FFPE单细胞数据处理案例与优化建议

作者: 刘雪岭

时长: 3 分钟

字数: 659 字

更新: 2025-09-02

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FFPE 处理背景细胞

案例背景

• 样本类型：胃癌FFPE（甲醛固定石蜡包埋）组织
• 问题描述：原始单细胞表达矩阵直接整合聚类效果不理想，cluster分群不明显，细胞类型注释困难，存在较多背景RNA干扰。

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数据处理与优化流程

1. 预处理与质量控制

• 对每个样本的表达矩阵进行初步质控。
• 采用 SoupX 去除背景RNA污染。
• 使用 DoubletFinder 过滤双细胞（doublets），过滤阈值：
  • UMI数：500-75,000
  • 基因数：200-7,500
  • 线粒体基因比例：<10%

TIP

FFPE样本由于RNA降解和背景污染严重，建议务必进行背景去除和双细胞过滤。

2. 聚类与注释效果对比

• 处理前：聚类分群不明显，细胞类型难以准确注释。
• 处理后：
  • SoupX去背景后，cluster边界清晰，分群改善明显。
  • DoubletFinder进一步去除双细胞，提升聚类纯度。
  • 细胞类型注释和marker基因表达分布更符合生物学预期。

图注：左为原始聚类，右为SoupX处理后聚类

图注：左为原始聚类，中为SoupX处理，右为DoubletFinder去除双细胞后，双细胞比例约6%

3. 细胞类型注释与marker基因表达

4. 经验总结与优化建议

IMPORTANT

FFPE样本常见问题包括RNA降解严重、总量低、片段短、细胞核完整性差、有核率低（20-30%）、背景RNA多，导致分群弥散。

• 数据处理建议：
  • 必须进行背景RNA去除（如SoupX）
  • 过滤双细胞（如DoubletFinder）
  • 严格质控（UMI、基因数、线粒体比例）
  • 特征选择高变基因，优化聚类参数（如PCA数、分辨率）
  • 批次整合建议用Harmony等方法优化参数
  • 聚类后结合marker基因手动调整亚群，去除混合群体

NOTE

聚类和注释效果的提升依赖于多环节优化，建议结合样本特性灵活调整参数。

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结论

本案例展示了针对FFPE及其它RNA表达文库样本，聚类分群不理想时的优化处理流程。通过背景去除、双细胞过滤和参数优化，可显著提升聚类和注释效果。该流程可作为类似问题的参考和建议，帮助用户提升FFPE及复杂样本的单细胞分析质量。