FFPE 单细胞数据处理：背景 RNA 去除、双细胞过滤与参数优化

作者: 刘雪岭

时长: 3 分钟

字数: 663 字

更新: 2026-01-26

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FFPE 单细胞转录组 FAQ FFPE 处理背景细胞

案例背景

• 样本类型：胃癌 FFPE (甲醛固定石蜡包埋) 组织
• 问题描述：原始单细胞表达矩阵直接整合聚类效果不理想，cluster 分群不明显，细胞类型注释困难，存在较多背景 RNA 干扰。

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数据处理与优化流程

预处理与质量控制

• 对每个样本的表达矩阵进行初步质控。
• 采用 SoupX 去除背景 RNA 污染。
• 使用 DoubletFinder 过滤双细胞 (doublets)，过滤阈值：
  • UMI 数：500-75,000
  • 基因数：200-7,500
  • 线粒体基因比例：<10%

TIP

FFPE 样本由于 RNA 降解和背景污染严重，建议务必进行背景去除和双细胞过滤。

聚类与注释效果对比

• 处理前：聚类分群不明显，细胞类型难以准确注释。
• 处理后：
  • SoupX 去背景后，cluster 边界清晰，分群改善明显。
  • DoubletFinder 进一步去除双细胞，提升聚类纯度。
  • 细胞类型注释和 marker 基因表达分布更符合生物学预期。

图注：左为原始聚类，右为 SoupX 处理后聚类

图注：左为原始聚类，中为 SoupX 处理，右为 DoubletFinder 去除双细胞后，双细胞比例约 6%

细胞类型注释与 marker 基因表达

经验总结与优化建议

IMPORTANT

FFPE 样本常见问题包括 RNA 降解严重、总量低、片段短、细胞核完整性差、有核率低 (20-30%)、背景 RNA 多，导致分群弥散。

• 数据处理建议：
  • 必须进行背景 RNA 去除 (如 SoupX)
  • 过滤双细胞 (如 DoubletFinder)
  • 严格质控 (UMI、基因数、线粒体比例)
  • 特征选择高变基因，优化聚类参数 (如 PCA 数、分辨率)
  • 批次整合建议用 Harmony 等方法优化参数
  • 聚类后结合 marker 基因手动调整亚群，去除混合群体

NOTE

聚类和注释效果的提升依赖于多环节优化，建议结合样本特性灵活调整参数。

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结论

本案例展示了针对 FFPE 及其它 RNA 表达文库样本，聚类分群不理想时的优化处理流程。通过背景去除、双细胞过滤和参数优化，可显著提升聚类和注释效果。该流程可作为类似问题的参考和建议，帮助用户提升 FFPE 及复杂样本的单细胞分析质量。