外源 GFP 未检出排查：GTF 注释修复与定量示例

作者: 高瑞峰

时长: 3 分钟

字数: 528 字

更新: 2026-01-21

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构建参考基因组 外源基因 分析指南

问题描述

在分析数据时，参考基因组中已构建外源插入基因 GFP，但在云平台分析结果中找不到 GFP 基因的表达。

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排查过程

1. 初步确认：
   • 表达矩阵中存在 GFP 基因，但 RDS 文件中未包含 GFP 基因，导致云平台分析无对应基因。
2. 样本验证：
   • 以某样品为例，BAM 文件可比对到 GFP 基因，且比对结果均为 150M。
   • 但 XS 标签均为 XS:Z:Unassigned_NoFeatures。
   • 说明 GFP 基因可被比对，但在 featureCounts 定量时未被识别。

zcat features.tsv.gz | grep -n GFP
zcat matrix.mtx.gz | awk -v gene_row=索引 '$1 == gene_row { count++ } END { print count }'
samtools view 某样品_SortedByCoordinate_withTag.bam | grep "GFP"

3. 多样本复查：
   • 其他样本同样存在定量未识别 GFP 基因的问题。

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原因分析

IMPORTANT

GFP基因在featureCounts定量未被识别，主要原因是GTF文件格式不规范：外源基因GFP的注释缺少gene和transcript行，仅有exon信息，导致featureCounts无法正确定量。

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解决办法

TIP

需重新构建包含 GFP 基因的 GTF 注释文件，确保包含 gene、transcript 和 exon 三类注释行。

标准 GFP 基因 GTF 格式示例：

# 添加gene行
echo -e 'GFP\tunknown\tgene\t1\t720\t.\t+\t.\tgene_id "GFP"; gene_name "GFP"; gene_biotype "protein_coding";' > GFP.gtf

# 添加transcript行 (使用 >> 追加)
echo -e 'GFP\tunknown\ttranscript\t1\t720\t.\t+\t.\tgene_id "GFP"; transcript_id "GFP"; gene_name "GFP"; gene_biotype "protein_coding";' >> GFP.gtf

# 添加exon行 (使用 >> 追加)
echo -e 'GFP\tunknown\texon\t1\t720\t.\t+\t.\tgene_id "GFP"; transcript_id "GFP"; gene_name "GFP"; gene_biotype "protein_coding"; exon_number 1; exon_id "GFP"' >> GFP.gtf

NOTE

使用修正后的 GTF 文件重新构建参考基因组并进行定量分析，GFP 基因即可被正常识别和定量。