全序列融合检测：STAR-Fusion 模块使用说明与结果解读
介绍
NOTE
本文档是关于《全序列-融合模块》的使用说明，描述如何获取融合模块的代码、数据，并给出运行示例和结果说明。
融合分析
IMPORTANT
基因融合是指两个或多个基因在染色体重排过程中发生的结构变化，形成新的融合基因。这里使用 STAR-Fusion 软件来做分析，该软件首先将 RNA-seq reads 比对到参考基因组，识别出可能的融合基因对，然后通过进一步的过滤和验证步骤，生成高置信度的融合基因候选列表。通过 STAR-Fusion 软件识别到的 junction-reads，可以根据其上的 barcode 和 UMI 标签信息来对应到单细胞上，这些将作为细胞的融合基因标签，进行画图或其他的下游分析。
数据获取
参考基因组
CAUTION
运行 STAR-Fusion 需要提前构建好基因组，人和小鼠的参考基因组可以在下方获取，其他物种可以参考 [installing star fusion · STAR-Fusion/STAR-Fusion Wiki]（https://github.com/STAR-Fusion/STAR-Fusion/wiki/installing-star-fusion）来构建。
NOTE
文件较大，分别约 30G，请按需下载：
# human
wget -c -O Fusion_refdata_human_GRCh38.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/FAST/Fusion.v1/Fusion_refdata_human_GRCh38.tar.gz"
# Decompress
mkdir Fusion_refdata_human_GRCh38
tar -zxvf Fusion_refdata_human_GRCh38.tar.gz -C Fusion_refdata_human_GRCh38# mouse
wget -c -O Fusion_refdata_mouse_mm10.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/FAST/Fusion.v1/Fusion_refdata_mouse_mm10.tar.gz"
# Decompress
mkdir Fusion_refdata_mouse_mm10
tar -zxvf Fusion_refdata_mouse_mm10.tar.gz -C Fusion_refdata_mouse_mm10环境
IMPORTANT
运行环境需包含 seeksoultools、STAR-Fusion，及其他所需软件。
# seeksoultools
wget -c -O seeksoultools_fast_mut_dev.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/FAST/Fusion.v1/seeksoultools_fast_mut_dev.tar.gz"
# Decompress
mkdir seeksoultools
tar -zxvf seeksoultools_fast_mut_dev.tar.gz -C seeksoultools
source seeksoultools/bin/activate
seeksoultools/bin/conda-unpack# Fusion_env
wget -c -O Fusion_env.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/FAST/Fusion.v1/Fusion_env.tar.gz"
# Decompress
mkdir Fusion_env
tar -zxvf Fusion_env.tar.gz -C Fusion_env
source Fusion_env/bin/activate
Fusion_env/bin/conda-unpack代码
TIP
分析代码和测试数据（人类细胞系，BCR-ABL1 融合）可以在这里获取：
wget -c -O Fusion_code.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/FAST/Fusion.v1/Fusion_code.tar.gz"
tar -zxvf Fusion_code.tar.gz运行示例
# Add custom tool directories to PATH
# Note: export seeksoultools first
export PATH="`pwd`/seeksoultools/bin:$PATH"
# making Fusion_env highest priority
export PATH="`pwd`/Fusion_env/bin:$PATH"
bash Fusion_code/Fusion.sh \
-s demo \
-l Fusion_code/testdata/BCR_ABL1_R1.fastq.gz \
-r Fusion_code/testdata/BCR_ABL1_R2.fastq.gz \
-c 8 \
-o ./output \
-g Fusion_refdata_human_GRCh38/ctat_genome_lib_build_dir \
-t Fusion_code/testdata/cellline.rds参数说明
| parameter | full-name | description |
|---|---|---|
| s | sample | sample name, required |
| l | R1_fq | raw-fastq data for R1; gz compression format, required |
| r | R2_fq | raw-fastq data for R2; gz compression format, required |
| c | CPU | CPU (default: 8) |
| o | outdir | path for output (default: ./output) |
| g | genome_lib_dir | ref-data for STAR-Fusion, required |
| t | rds | Seurat Object, required; meta.data for this object needs to include the "Sample" column |
注
WARNING
- 本模块仅限于单样本分析，多样本请分别编写脚本并运行
- 输入的 R1/R2 需为原始全序列/Panel 测试数据
- 当输入数据是 Panel 数据时，"-t" 参数输入的 RDS，需为对应全序列数据经过单细胞质控过程所得到的 RDS
- 融合分析需较大资源，测序数据越大，耗时和所需资源就越大，测序 100G 的数据参考使用 32C128GB 或更多
运行过程
NOTE
原始测序数据经过 fastp 质控、seeksoultools 提取引物后并得到 clean 数据后，调用 STAT-Fusion 程序来识别融合事件。根据 JunctionReads 上的 barcode 和 UMI 标签信息，可以分辨哪些细胞是带有融合 reads，有多少个 UMI 是检测到融合 reads。将这些作为细胞的新标签，可以进行后续的分析。从中筛选出 JunctionReads 大于等于 10 并且细胞数大于等于 2 的融合。
主要结果说明
以下描述主要输出结果，更多输出结果的详细描述可参考 STAR-Fusion 官方网站 [Home · STAR-Fusion/STAR-Fusion Wiki]（https://github.com/STAR-Fusion/STAR-Fusion/wiki）。
STAR/sample/star-fusion.fusion_predictions.tsv
IMPORTANT
该表格包含识别到的所有融合基因结果，详细描述了每个融合的断点、支持 reads 数目、左右区域信息和 PFAM 数据库信息等。从 LeftBreakpoint 和 RightBreakpoint 可以获得融合断点位置，也是后续区分融合的唯一标识符。支持融合的 reads 越多，剪接模式符合生物学意义，该结果越可信。
（1）X.FusionName：融合基因
（2）JunctionReadCount：包含在假定融合连接位点处，一条read可以拆分匹配到两侧融合基因的reads数量
（3）SpanningFragCount：包含融合连接的reads数量，该reads的R1端和R2端对应基因不同
（4）est_J：Junction原始读取reads数量（考虑了多重比对和 fusion 转录本的多样性后的估计值）
（5）est_S：Spanning原始读取read counts（考虑了多重比对和fusion转录本的多样性后的估计值）
（6）SpliceType: 融合基因断点是否出现在参考转录本结构注释（例如gencode）提供的参考外显子连接处
（7）LeftGene：融合基因左侧基因
（8）LeftBreakpoint：融合基因断点左侧染色体位置信息（GRCh38）
（9）RightGene：融合基因右侧基因
（10）RightBreakpoint：融合基因断点右侧染色体位置信息（GRCh38）
（11）LargeAnchorSupport：在假定断点两侧是否存在reads的较长碱基序列（≥25）匹配，缺少LargeAnchorSupport的融合基因通常为假阳性
（12）FFPM：支持融合的reads的标准化结果，即每百万总reads数的融合量
（13）LeftBreakDinuc：与断点相邻的左边两个核苷酸。如果左/右接头的结果是GT-AG或GC-AG，那么很可能这是一个拼接断点
（14）LeftBreakEntropy：断点左侧的15个外显子碱基的香农熵（0-2，低熵位点通常被视为可信度较低的断点）
（15）RightBreakDinuc： 与断点相邻的右边两个核苷酸
（16）RightBreakEntropy：断点右侧的15个外显子碱基的香农熵
（17）annots：融合转录本的简单注释output/plots/*.png
NOTE
对每个融合分别用 UMAP、t-SNE 图展示，图中数值代表检测到该融合的 UMI 数目，颜色越红代表该细胞表达该融合的值越高。右边表格表示发生该融合的细胞比例，cells 表示总细胞数，fusion_cells 表示发生该融合的细胞数，percent 表示占比。