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表面蛋白 - CRISPR - 混样(Multiplex)参考表格(Feature Reference)填写指南 ​

作者: SeekGene
时长: 19 分钟
字数: 4.8k 字
更新: 2026-10-13
阅读: 0 次
3' 转录组 5' + 免疫组库 分析指南

本文档帮助您填写 Feature Barcode 信息(抗体、CRISPR、Hashing 等),用于 Cell Ranger 分析。请根据产品类型及建库方式(3' / 5')选择对应内容,提供正确且完整的信息表格。

目录 ​


参考表格填写注意事项 ​

产品简介 ​

产品简述检测对象
表面蛋白检测(Cell Surface Protein / CITE-seq, Antibody Capture)用抗体-寡核苷酸标签,在单细胞转录组测序中同步定量表面蛋白表面蛋白(如 CD3、CD4 等)
CRISPR Guide Capture(CRISPR 筛选 / Perturb-seq)捕获单个细胞中的 sgRNA,关联基因扰动与转录组表型sgRNA 序列
样本混样(Multiplex: Hashing / CellPlex CMO)多样本混合测序,利用标签在分析时拆分为单样本细胞来源样本的标签信息

基础概念(所有产品通用) ​

无论是表面蛋白、CRISPR 还是混样样本,Cell Ranger 分析这类数据都需要一份 Feature Reference CSV,用于告诉软件:

  1. 每一个 Feature(抗体 / sgRNA / Hashtag)的名称和编号;
  2. 该 Feature 的标签序列(Barcode 序列);
  3. 这个标签序列在测序读长(Read)中的具体位置和提取模式(pattern);
  4. 该 Feature 属于哪一类分析(抗体、CRISPR 还是混样)。

所有产品类型共享 6 个通用必填列,列名和顺序固定;CRISPR 产品还需额外填写 2 个专属列(详见「CRISPR Guide Capture」):

列名含义是否必填
idFeature 唯一编号(如 CD3、sgTP53-1、Hashtag1),不能有空格、斜杠、引号或逗号等特殊符号;不能与转录组中基因名相同✅ 必填
nameFeature 展示名称;可与 id 相同,不要求唯一;会在 matrix/features.tsv.gz 里展示;同样不能有空格、斜杠、引号或逗号等特殊符号✅ 必填
read该 Feature 标签序列所在的测序读长,通常为 R2(个别情况为 R1)✅ 必填
pattern一段固定序列,表明标签序列在 read 中的位置(详见下方说明)✅ 必填
sequence标签序列,例如表面蛋白抗体序列或 sgRNA protospacer 序列✅ 必填
feature_typeFeature 类型:Antibody Capture / CRISPR Guide Capture / Multiplexing Capture✅ 必填

Pattern 语法说明 ​

符号含义
5P 或 ^表示 pattern 从 read 起始位置开始匹配(只能出现在 pattern 最前面,二者选一,不可同时使用)
3P 或 $表示 pattern 在 read 末端(只能出现在 pattern 最后面,同上)
N任意碱基(占位,不校验)
A / C / G / T固定碱基,必须与 sequence 完全一致
(BC)表示 Feature Barcode 实际序列所在位置,每条 pattern 中必须且只能出现一次,对应 sequence 列的内容

Pattern 示例:

  • 5PNNNNNNNNNN(BC):pattern 位于 read 的开头,紧跟其后的序列即为 sequence 序列。

  • ^(BC):表示从序列的起始位置直接读取 sequence 序列。

  • (BC)GTTTAAGAGCTAAGCTGGAA:pattern 序列为 GTTTAAGAGCTAAGCTGGAA,其前面的序列为 sequence 序列。

  • TTCCAGCTTAGCTCTTAAAC(BC):pattern 序列为 TTCCAGCTTAGCTCTTAAAC,其后面的序列为 sequence 序列。

  • pattern 序列长度应适中:太长容易受测序错误影响,太短则不利于唯一识别 sequence 序列。对于非 N 的固定序列部分,建议长度为 12–20 bp。

  • Cell Ranger 会根据 pattern 识别并提取 sequence 序列,再与参考表格中的 sequence 进行匹配。匹配时最多允许一个碱基错配,并使用 barcode 校正算法完成比对。

通用填写注意事项(务必检查) ​

  • 文件必须为纯 ASCII 编码 CSV 格式,不要使用 Excel 另存后带有中文全角符号、BOM 头或特殊符号的版本。
  • 每一行对应一个唯一的 Feature Barcode,id 列在整份文件(包括同时存在的抗体 + 混样标签)中不可重复,也不能与后续基因名 / 探针 ID 冲突。
  • id 列建议只使用字母、数字、下划线 _、短横线 -,不要使用竖线 |、逗号、空格(竖线在 multi config CSV 中另有含义)。
  • 如果同一实验中既有「抗体检测」又有「样本混样(Hashing)」,两部分 Feature 信息需要写在同一份 Feature Reference CSV 中(各自 feature_type 不同即可),不要拆成两个文件。
  • sequence 列务必确认是正确的。采购自供应商的,请向抗体 / sgRNA / Hashtag 供应商提供的最新序列表核对。对于 CRISPR 产品,需确认提供的是 sgRNA 本身(即最终会被转录、被测序读到)的那条链序列,序列错误会导致该 Feature 无法被识别(计数为 0)。

表面蛋白 ​

表面蛋白检测通常使用 BioLegend TotalSeq™ 系列,标签序列在 R2 read 中的位置因抗体类型不同而不同。

5' 样本的表面蛋白文库以 _Pro 为样本名后缀,3' 样本的表面蛋白文库以 _ADT 为样本名后缀。feature_type 固定填 Antibody Capture。

TotalSeq-A(兼容 3' v2 / 3' v3 kits) ​

  • 适配数据类型:3' 基因表达(Single Cell 3' v2 / v3)。
  • 标签序列位于 R2 read 最起始位置(无前置间隔序列)。
  • read = R2,pattern = 5P(BC)。

示例(仅需要修改 id / name / sequence,以您的实际情况来填写):

csv
id,name,read,pattern,sequence,feature_type
CD3,CD3_TotalSeqA,R2,5P(BC),ATTGGCACTCAGATG,Antibody Capture
CD4,CD4_TotalSeqA,R2,5P(BC),TACCCGTAATAGCGT,Antibody Capture

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TotalSeq-B(兼容 3') ​

  • 适配数据类型:3' 基因表达。
  • 标签序列位于 R2 read 固定第 10 个碱基起始(前面有 10 bp 随机序列)。
  • read = R2,pattern = 5PNNNNNNNNNN(BC)。

示例(仅需要修改 id / name / sequence,以您的实际情况来填写):

csv
id,name,read,pattern,sequence,feature_type
CD3,CD3_TotalSeqB,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),AACAAGACCCTTGAG,Antibody Capture
CD4,CD4_TotalSeqB,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),TACCCGTAATAGCGT,Antibody Capture

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TotalSeq-C(兼容 5' / V(D)J) ​

  • 适配数据类型:5' 基因表达 / V(D)J 免疫文库。
  • 标签序列同样位于 R2 固定第 10 个碱基起始。
  • read = R2,pattern = 5PNNNNNNNNNN(BC)。

示例(仅需要修改 id / name / sequence,以您的实际情况来填写):

csv
id,name,read,pattern,sequence,feature_type
CD3,CD3_TotalSeqC,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),CTCATTGTAACTCCT,Antibody Capture
CD19,CD19_TotalSeqC,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),CTGGGCAATTACTCG,Antibody Capture

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样本混样 ​

样本混样用于将多个样本混合上机,事后通过标签(Hashtag / CMO barcode)在计算层面拆分回各个样本。10x 目前支持以下混样方式,填写要求各不相同,请先确认您使用的是哪一种:

混样方式适用平台标签来源Feature Reference 是否需要
Antibody Capture Hashing(TotalSeq Hashtag)3' 或 5' 基因表达抗体厂商提供的 Hashtag 序列✅ 需要提供
3' CellPlex(CMO)3' 基因表达10x 官方 CMO 标签(内置于软件,通常无需自建)使用官方 CMO 无需提供;使用第三方 / 自定义标签(如 TotalSeq 系列做 Hashing)时需要提供

目前,下机数据中 3' 混样数据名称常以 _HTO 作为样本名后缀。5' 混样文库仍以 _Pro 为样本后缀。

Antibody Capture Hashing(最常见,基于表面蛋白进行混样) ​

若使用 TotalSeq-A / B / C Hashtag 抗体进行样本混样:

  • 需自行提供 Feature Reference,写法与对应类型的表面蛋白抗体完全一致。
  • 提前告知是基于表面蛋白的混样分析,并且哪些是混样标签,便于后续生信分析(重要)。
  • feature_type 填写 Antibody Capture。
  • 混样分析必须同时提供转录组(Gene Expression)数据,仅混样数据无法分析。

只用表面蛋白做混样 ​

以 TotalSeq-A Hashtag(用于 3' 数据)为例(仅需要修改 id / name / sequence,以您的实际情况来填写):

csv
id,name,read,pattern,sequence,feature_type
TotalSeqA_Hashtag_1,TotalSeqA_Hashtag_1,R2,5P(BC),ATCACATCGTTGCCA,Antibody Capture
TotalSeqA_Hashtag_2,TotalSeqA_Hashtag_2,R2,5P(BC),CTCTAGGTTCCCACC,Antibody Capture
TotalSeqA_Hashtag_3,TotalSeqA_Hashtag_3,R2,5P(BC),AGCTCACTTGTCCTG,Antibody Capture
TotalSeqA_Hashtag_4,TotalSeqA_Hashtag_4,R2,5P(BC),GTATGTTCTGCAATT,Antibody Capture

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以 TotalSeq-B Hashtag(用于 3' 数据)为例(仅需要修改 id / name / sequence,以您的实际情况来填写):

csv
id,name,read,pattern,sequence,feature_type
TotalSeqB_Hashtag_1,TotalSeqB_Hashtag_1,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),GTCAACTCTTTAGCG,Antibody Capture
TotalSeqB_Hashtag_2,TotalSeqB_Hashtag_2,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),TGATGGCCTATTGGG,Antibody Capture

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以 TotalSeq-C Hashtag(用于 5' 数据)为例(仅需要修改 id / name / sequence,以您的实际情况来填写):

csv
id,name,read,pattern,sequence,feature_type
TotalSeqC_Hashtag_1,TotalSeqC_Hashtag_1,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),GTCAACTCTTTAGCG,Antibody Capture
TotalSeqC_Hashtag_2,TotalSeqC_Hashtag_2,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),TGATGGCCTATTGGG,Antibody Capture
TotalSeqC_Hashtag_3,TotalSeqC_Hashtag_3,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),TTCCGCCTCTCTTTG,Antibody Capture
TotalSeqC_Hashtag_4,TotalSeqC_Hashtag_4,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),AGTAAGTTCAGCGTA,Antibody Capture

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同时有表面蛋白文库和 Hashtag 混样 ​

在同时有表面蛋白和Hashtag混样时,通过id列是否包含"Hashtag"字样来区分哪个是混样标签。

例如以 TotalSeq-B 来作为标签,TotalSeqB_Hashtag_1和TotalSeqB_Hashtag_2是混样标签,CD3_TotalSeqB和CD4_TotalSeqB,CD8a_TotalSeqB是抗体标签。

参考表格可以参考(需要修改 id / name / sequence,以您的实际情况来填写):

csv
id,name,read,pattern,sequence,feature_type
TotalSeqB_Hashtag_1,TotalSeqB_Hashtag_1,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),GTCAACTCTTTAGCG,Antibody Capture
TotalSeqB_Hashtag_2,TotalSeqB_Hashtag_2,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),TGATGGCCTATTGGG,Antibody Capture
CD3_TotalSeqB,CD3,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),AACAAGACCCTTGAG,Antibody Capture
CD4_TotalSeqB,CD4,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),TACCCGTAATAGCGT,Antibody Capture
CD8a_TotalSeqB,CD8a,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),ATTGGCACTCAGATG,Antibody Capture

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生信分析注意事项 ​

生信在分析时,会在配置文件 [samples] 部分添加 sample_id 和 hashtag_ids,用于后续数据的拆分 (生信负责配置,无需额外提供信息)。

拆分后样本名称、sample_id 和 hashtag_ids 均与 id 保持一致。

csv
[samples]
sample_id,hashtag_ids
TotalSeqB_Hashtag_1,TotalSeqB_Hashtag_1
TotalSeqB_Hashtag_2,TotalSeqB_Hashtag_2

若同一样本使用了多个抗体 Hashtag(技术重复),可用竖线分隔多个编号,例如 ABHT-1|ABHT-2。示例 (生信负责配置,无需额外提供信息):

WARNING

此类情况,请提前告知!

csv
[samples]
sample_id,hashtag_ids
Sample1,TotalSeqB_Hashtag_1|TotalSeqB_Hashtag_2
Sample2,TotalSeqB_Hashtag_3

3' CellPlex with CMO ​

CMO(Cell Multiplexing Oligo)基于脂质锚定 oligo 来进行混样。

  • 混样分析必须同时提供转录组(Gene Expression)数据,仅混样数据无法分析。
  • feature_type 填写 Multiplexing Capture。
  • 请确认 CMO 标签是 Cell Ranger 默认的还是自定义的。

使用 10x 官方 CMO 标签 ​

10x 官方提供了 12 种默认 CMO 标签(CMO301–CMO312)并内置到了 Cell Ranger 分析软件里。如果使用的是 10x 的官方标签,在 Feature Reference CSV 里可以不列出来 sequence 序列,只提供用到的 CMO 标签 id 即可。

csv
id,name,read,pattern,sequence,feature_type
CMO301,CMO301,R2,5P(BC),ATGAGGAATTCCTGC,Multiplexing Capture
CMO302,CMO302,R2,5P(BC),CATGCCAATAGAGCG,Multiplexing Capture
CMO303,CMO303,R2,5P(BC),CCGTCGTCCAAGCAT,Multiplexing Capture
CMO304,CMO304,R2,5P(BC),AACGTTAATCACTCA,Multiplexing Capture
CMO305,CMO305,R2,5P(BC),CGCGATATGGTCGGA,Multiplexing Capture
CMO306,CMO306,R2,5P(BC),AAGATGAGGTCTGTG,Multiplexing Capture
CMO307,CMO307,R2,5P(BC),AAGCTCGTTGGAAGA,Multiplexing Capture
CMO308,CMO308,R2,5P(BC),CGGATTCCACATCAT,Multiplexing Capture
CMO309,CMO309,R2,5P(BC),GTTGATCTATAACAG,Multiplexing Capture
CMO310,CMO310,R2,5P(BC),GCAGGAGGTATCAAT,Multiplexing Capture
CMO311,CMO311,R2,5P(BC),GAATCGTGATTCTTC,Multiplexing Capture
CMO312,CMO312,R2,5P(BC),ACATGGTCAACGCTG,Multiplexing Capture

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运行时,会在配置文件的 [samples] 部分列出使用的 cmo_ids 以便于数据拆分 (生信负责配置,无需额外提供信息):

csv
[samples]
sample_id,cmo_ids
sample1,CMO301
sample2,CMO303

使用自定义 CMO 混样标签 ​

使用自定义混样标签时,需要提供完整的参考表格,包括 id / name / read / pattern 序列和实际的 sequence 序列。feature_type 固定填 Multiplexing Capture。

示例(需要修改 id / name / pattern / sequence,以您的实际情况来填写):

csv
id,name,read,pattern,sequence,feature_type
HTO1,HTO1,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),CTCATTGTAACTCCT,Multiplexing Capture
HTO2,HTO2,R2,5PNNNNNNNNNN(BC),CTGGGCAATTACTCG,Multiplexing Capture

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运行时,会在配置文件中额外指定 cmo-set 参考序列表格位置,并指定 cmo_ids (生信负责配置,无需额外提供信息):

csv
[gene-expression]
reference,/path/to/transcriptome
cmo-set,/path/to/custom_cmo_ref.csv
create-bam,true
[samples]
sample_id,cmo_ids
sample1,HTO1
sample2,HTO2

若同一样本使用了多个 CMO 标签(技术重复),可用竖线分隔多个编号,例如 CMO301|CMO302。示例:

WARNING

此类情况,请提前告知!

csv
[samples]
sample_id,cmo_ids
sample1,CMO301|CMO302
sample2,CMO303|CMO304

CRISPR Guide Capture ​

CRISPR Guide Capture 用于检测单细胞内导入的 sgRNA(protospacer),其 Feature Barcode 即为 sgRNA 的 protospacer 序列本身。

CRISPR 产品共有 8 个信息列(在通用 6 列基础上新增 2 列):

列名含义是否必填
idFeature 唯一编号,不能有空格、斜杠、引号或逗号等特殊符号;不能与转录组中基因名相同✅ 必填
nameFeature 展示名称;可与 id 相同,不要求唯一;会在 matrix/features.tsv.gz 里展示;同样不能有空格、斜杠、引号或逗号等特殊符号✅ 必填
readR2✅ 必填
pattern一段固定序列,表明标签序列在 read 中的位置,一般为 12–20 bp✅ 必填
sequence标签序列,也是 sgRNA protospacer 序列,不能有重复✅ 必填
feature_typeCRISPR Guide Capture✅ 必填
target_gene_id目标基因 ID,如 ENSG00000113812✅ 必填(执行 perturbation effect 分析时必填;仅需 sgRNA 计数时可留空)
target_gene_name目标基因名称,如 ACTR8✅ 必填

填写注意事项 ​

  • sequence 列填写每条 sgRNA 的 protospacer 序列,不含 scaffold / 骨架序列,长度需与实际设计一致。
  • 当 target_gene_id 整列为空时,可以正常运行,但不会执行 perturbation effect 分析。
  • target_gene_id 和 target_gene_name 列需要与基因组(GTF)中的 gene_id 和 gene_name 一致,分析过程中会做校验,不在基因组中的将无法分析。
  • 5' CRISPR 需要额外注意 sgRNA 序列方向:测序读段方向为 5'→3',但在 5' CRISPR Guide Capture 文库中,建库时 sgRNA 以反向捕获,因此 Feature Reference CSV 中的 pattern 必须填写原始设计序列的反向互补,而非正向序列。若为 5' CRISPR Guide Capture 实验,请务必确认提交的是「原始序列」还是「已转换序列」,如有疑问请提前沟通,避免因方向错误导致返工。
  • sgRNA 序列不能有重复,若不同基因的 sgRNA 序列意外重复,需提前排查并沟通,避免运行失败或歧义计数。
  • 确认是否包含非靶向对照(Non-Targeting):如有,请单独列出,并在 id / name 中明确标注为 Non-Targeting,便于后续下游分析时区分阴性对照。

3' CRISPR 参考表格填写示例(以您的实际情况来填写):

csv
id,name,read,pattern,sequence,feature_type,target_gene_id,target_gene_name
ACTR8-1,ACTR8-1,R2,(BC)GTTTAAGAGCTAAGCTGGAA,GAAGGGCGGCGAGAAGGAGA,CRISPR Guide Capture,ENSG00000113812,ACTR8
ACTR8-2,ACTR8-2,R2,(BC)GTTTAAGAGCTAAGCTGGAA,GAGAACGGAAAGGAGAAGGG,CRISPR Guide Capture,ENSG00000113812,ACTR8
NEG_CTRL-1,NEG_CTRL-1,R2,(BC)GTTTAAGAGCTAAGCTGGAA,GACCGGGGGGGTGCGATGTA,CRISPR Guide Capture,Non-Targeting,Non-Targeting
NEG_CTRL-2,NEG_CTRL-2,R2,(BC)GTTTAAGAGCTAAGCTGGAA,GTGTACTAGTGACGACTATA,CRISPR Guide Capture,Non-Targeting,Non-Targeting

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5' CRISPR 参考表格填写示例(以您的实际情况来填写):

csv
id,name,read,pattern,sequence,feature_type,target_gene_id,target_gene_name
ACTR8-1,ACTR8-1,R2,TTCCAGCTTAGCTCTTAAAC(BC),TCTCCTTCTCGCCGCCCTTC,CRISPR Guide Capture,ENSG00000113812,ACTR8
ACTR8-2,ACTR8-2,R2,TTCCAGCTTAGCTCTTAAAC(BC),CCCTTCTCCTTTCCGTTCTC,CRISPR Guide Capture,ENSG00000113812,ACTR8
NEG_CTRL-1,NEG_CTRL-1,R2,TTCCAGCTTAGCTCTTAAAC(BC),TACATCGCACCCCCCCGGTC,CRISPR Guide Capture,Non-Targeting,Non-Targeting
NEG_CTRL-2,NEG_CTRL-2,R2,TTCCAGCTTAGCTCTTAAAC(BC),TATAGTCGTCACTAGTACAC,CRISPR Guide Capture,Non-Targeting,Non-Targeting

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Pattern 特殊处理:3' vs 5' 对比 ​

对比项3' CRISPR5' CRISPR
捕获方向正向捕获反向捕获
pattern 填写使用原始设计序列的 scaffold 上游序列使用原始设计序列的 反向互补
pattern 示例(BC)GTTTAAGAGCTAAGCTGGAATTCCAGCTTAGCTCTTAAAC(BC)
sequence 方向原始 protospacer 序列原始 protospacer 序列(不变)

IMPORTANT

5' CRISPR 最容易出错的地方是 pattern 序列方向。请务必确认:pattern 是 scaffold 上游序列的反向互补,而非正向序列。如有疑问请提前沟通,避免因方向错误导致返工。

Pattern 序列确认示例 ​

示例数据为 5' + CRISPR,使用 Addgene: lentiCRISPR v2 产品,可直接在官网上确认 pattern 序列。

进入网页后,找到 sequence 序列中的 sgRNA scaffold 序列:

gRNA 转录本从 5' 到 3' 端的基本结构为:

5' — guide sequence(spacer) + sgRNA scaffold — 3'

  • guide sequence:设计用于靶向特定基因的一段碱基序列,是实验中唯一变化的部分。
  • sgRNA scaffold:同一载体系统中骨架序列固定不变,负责与 Cas9 蛋白结合。

因此,pattern 序列位于 scaffold 序列的 5' 端。考虑到序列长度需要适中(过长容易受测序错误影响,过短则不易准确识别),选择 scaffold 紧邻上游的 20 bp GTTTTAGAGCTAGAAATAGC 作为 pattern。又因 5' + CRISPR 实验为反向捕获,需取其反向互补序列,因此最终 pattern 序列为 GCTATTTCTAGCTCTAAAAC(BC)。


总体填写检查清单(提交前自查) ​

以下按实际填写顺序排列,建议逐项核对:

  • [ ] Step 1: 确认具体产品组合(3' / 5'、是否 V(D)J、是否 CRISPR、是否混样)及各样本与标签的对应关系表。
  • [ ] Step 2: 创建文件为 UTF-8 / ASCII 纯文本 CSV,确保无中文全角逗号、无 BOM 头。
  • [ ] Step 3: 填写表头列名严格为 id,name,read,pattern,sequence,feature_type(CRISPR 额外增加 target_gene_id,target_gene_name),顺序不能打乱。
  • [ ] Step 4: 确保 id 全文件唯一,且不含空格、逗号、竖线。
  • [ ] Step 5: 确认 read 与 pattern 与所选建库化学匹配(3' TotalSeq-A → 5P(BC);3' TotalSeq-B/C → 5PNNNNNNNNNN(BC);CRISPR 3' → (BC)...;CRISPR 5' → ...反向互补(BC))。
  • [ ] Step 6: 核对 sequence 为正确序列,长度与 pattern 中 (BC) 的预期长度一致。
  • [ ] Step 7: 确认 feature_type 填写正确:表面蛋白 → Antibody Capture;CRISPR → CRISPR Guide Capture;混样(Hashtag 方式)→ Antibody Capture;混样(CMO 方式)→ Multiplexing Capture。
  • [ ] Step 8: 若同时包含抗体检测与样本混样,两者信息合并在同一份 Feature Reference CSV 中。

如对以上任何一项不确定,请在提交前与我们联系确认,避免因文件格式或字段错误导致分析返工。


参考资料 ​

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