单细胞 scATAC-seq & scRNA-seq 双组学标准分析：数据质控

作者: 舒梦

时长: 7 分钟

字数: 1.7k 字

更新: 2025-11-13

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数据分析单细胞多组学 seekARC

一、质控目的

剔除细胞碎片、双细胞、死细胞等异常barcode，确保分析只包含高质量、真实的单细胞。

油滴包裹单细胞的正确状态

下图为理想情况：一个油滴只包裹一个完整细胞。但实际实验中也可能出现油滴包裹多个细胞（双胞，Doublet），或者油滴内包裹的是一些游离的细胞碎片。两者在质控中都应被去除。

二、关键指标与建议

1) RNA 端质控

核心指标（阈值需按数据灵活调整）：

每个细胞检测到的基因数（nFeature_RNA）：该指标太低提示是细胞碎片而非真实的细胞，该指标太高提示是双细胞，并非独立的单个细胞，常用阈值建议 200~6000（具体阈值可结合小提琴图适当调整）。
每个细胞总 UMI（nCount_RNA）：反映每个细胞内所有转录本分子的总捕获量，通常与基因数协同变化。常用筛选范围为 500–10,000（具体阈值可结合小提琴图适当调整）。
线粒体基因占比（percent.mt）：该指标用于过滤可能的死细胞，线粒体占比高于 20% 或 25% 常提示细胞受到应激、破损或处于死亡状态。常用推荐阈值为 ≤10%～20%。

# 计算线粒体基因百分比（以人类基因为例，线粒体基因通常以 "MT-" 开头）
data[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(
  object = data,
  pattern = "^MT-"
)

# 绘制 RNA 端质控小提琴图（nFeature_RNA, nCount_RNA, percent.mt）
VlnPlot(
  object = data,
  features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"),
  ncol = 3,
  pt.size = 0
)

小提琴图中离群点（如nFeature_RNA极低或极高，percent.mt异常升高等）往往反映质量不佳的细胞，这些区域适合作为过滤阈值。建议结合经验推荐范围和小提琴图形态，灵活对阈值进行微调，以最大程度保留高质量细胞并去除噪音。

2) ATAC 端质控

建议评估以下指标：

TSS 富集分数（TSS.enrichment）：衡量细胞染色体状体的一个指标。TSS高富集状态提示染色质开放状态良好，通常对应细胞存活和转录稳态良好。TSS 富集分数过低常见于染色质降解、细胞死亡或技术噪音。可用 TSSEnrichment() 计算。常用阈值建议 ≥1–2（推荐下限，具体阈值需结合小提琴图适当调整）。

# 运行TSS富集分数计算
data <- TSSEnrichment(
 object = data,
 assay = "ATAC"
)

# 结果会被添加到 meta.data 的 TSS.enrichment 列

核小体信号（nucleosome_signal）：描述单核小体片段（~147bp）与无核小体片段（<100bp）的比例。优质细胞由于染色质结构完整，会在片段长度分布中呈现高低交替、约 200bp 除数的周期性波峰，反映细胞内核小体排列和染色质包装的生理状态。核小体信号异常升高提示细胞凋亡、降解或过多双胞等非生理状态。常用推荐阈值 ≤2，大于此值建议剔除。

# 计算核小体信号（nucleosome_signal）
data <- NucleosomeSignal(
  object = data,
  assay = "ATAC"
)

# 结果会被添加到 meta.data 的 nucleosome_signal 列

ATAC 片段总数（nCount_ATAC）：该指标和上述的nCount_RNA类似，是从ATAC层面来过滤碎片或双细胞的，常见推荐范围为 1,000–80,000（具体阈值需结合小提琴图适当调整）。

# 绘制 ATAC 端质控小提琴图（TSS.enrichment, nucleosome_signal, nCount_ATAC）
VlnPlot(
  object = data,
  features = c("TSS.enrichment", "nucleosome_signal", "nCount_ATAC"),
  ncol = 3,
  pt.size = 0
)

同样利用小提琴图帮助我们直观可视化ATAC层面各项 QC 指标的分布，辅助判断合理的过滤阈值，并发现异常或低质量细胞。

三、常见问题

Q1：我用Signac官网教程处理seekARC数据，教程里面有用到一个singlecell.csv文件，你们没提供这个文件给我呀？
A：老师用的应该是处理scATAC-seq单组学数据的教程，在单组学教程里面，singlecell.csv文件是为了计算pct_reads_in_peaks指标，从而实现细胞过滤，Signac有提供一胞双组学的指定教程https://stuartlab.org/signac/articles/pbmc_multiomic，双组学数据过滤是不需要这个指标的，所以我们没有提供。

Q2：为什么在Signac多组学（ATAC+RNA）分析时，不用pct_reads_in_peaks指标来过滤细胞？
A：pct_reads_in_peaks（peak区reads占比）主要用于单组学ATAC质量控制，反映信噪比；单组学时没有其他数据支持，需要严格用它剔除低质量细胞。但在多组学数据中，RNA信息可作为ATAC数据质控的互补。如果细胞的RNA数据表现好，即使pct_reads_in_peaks稍低也可能是生物学真实、有价值的细胞。部分亚型细胞天然pct_reads_in_peaks低，若强行筛选可能丢失关键信息。因此，Signac在多组学中更关注TSS.enrichment、nucleosome_signal等稳健指标，通过ATAC与RNA交叉验证整体质量，无需强制用pct_reads_in_peaks过滤。

Q3：中性粒细胞会如何影响多组学数据的质控指标？
A： 1）中性粒细胞被激活（如受炎症刺激）时，染色质会解聚并释放到细胞外，形成与组蛋白结合的“中性粒细胞胞外诱捕网”（NETs），以清除病原体。这类事件会产生大量、分布随机的小DNA片段，在测序数据中表现为：

TSS富集度、overlap peaks等指标显著下降；
染色体上这些碎片的占比可高达60%，且大部分难以被归入ATAC调用的peak区域；
包含大量此状态中心粒的样本不适合做scATAC-seq测序。

2）未被激活、处于静息（终末分化）状态的中性粒细胞，尽管整体转录活性较低，但其染色质结构完整，各项常规质控指标（如TSS.enrichment、overlap peaks等）通常处于正常范围，仅基因表达量（nFeature_RNA、nCount_RNA）与ATAC片段总量（nCount_ATAC）中位数相对较低。这属于生理现象，实际数据中也常见。

单细胞 scATAC-seq & scRNA-seq 双组学标准分析：数据质控 ​

一、质控目的 ​

油滴包裹单细胞的正确状态 ​

二、关键指标与建议 ​

1) RNA 端质控 ​

2) ATAC 端质控 ​

三、常见问题 ​