SeekArc 单细胞多组学 (RNA+ATAC) 单样本分析教程 (WNN)

作者: SeekGene

时长: 20 分钟

字数: 4.5k 字

更新: 2026-02-28

阅读: 0 次

ATAC + RNA 双组学 分析指南 Notebooks 基础分析

环境准备

R 包加载

请选择 common_r 这个环境进行该整合教程的学习

#加载必要的R包
suppressPackageStartupMessages({
  library(Seurat)
  library(Signac)
  library(EnsDb.Hsapiens.v86, lib.loc = "/PROJ2/FLOAT/shumeng/apps/miniconda3/envs/python3.10/lib/R/library")
  library(BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg38,lib = "/PROJ2/FLOAT/shumeng/apps/miniconda3/envs/python3.10/lib/R/library")
  library(biovizBase, lib = "/PROJ2/FLOAT/shumeng/apps/miniconda3/envs/python3.10/lib/R/library")
  #library(BSgenome.Mmusculus.UCSC.mm10)
  #library(EnsDb.Mmusculus.v79)
  library(dplyr)
  library(ggplot2)
  library(patchwork)
  library(harmony)
})

# 设置随机种子
set.seed(1234)

# 设置Seurat选项（注意：8000 * 1024^2 实际上是8GB）
options(future.globals.maxSize = 8000 * 1024^2)  # 8GB

# 定义颜色方案
my36colors <-c( '#E5D2DD', '#53A85F', '#F1BB72', '#F3B1A0', '#D6E7A3', '#57C3F3', '#476D87',
                '#E95C59', '#E59CC4', '#AB3282', '#23452F', '#BD956A', '#8C549C', '#585658',
                '#9FA3A8', '#E0D4CA', '#5F3D69', '#C5DEBA', '#58A4C3', '#E4C755', '#F7F398',
                '#AA9A59', '#E63863', '#E39A35', '#C1E6F3', '#6778AE', '#91D0BE', '#B53E2B',
                '#712820', '#DCC1DD', '#CCE0F5', '#CCC9E6', '#625D9E', '#68A180', '#3A6963',
                '#968175', "#6495ED", "#FFC1C1",'#f1ac9d','#f06966','#dee2d1','#6abe83','#39BAE8','#B9EDF8','#221a12',
                '#b8d00a','#74828F','#96C0CE','#E95D22','#017890')

获取基因注释信息

我们将从 EnsDb 数据库获取相应物种的基因组注释信息（基因位置、转录本、外显子、TSS 等）,具体物种需根据数据做更换。这些信息用于：

• 计算 ATAC 的 TSS 富集（判断开放染色质是否在转录起始位点附近更集中）
• 构建基因活性矩阵（把 peaks 信号映射到基因上）
• Peak 注释和功能分析

注意事项：

• 物种与参考基因组版本匹配（如EnsDb.Hsapiens.v86对应 hg38，EnsDb.Mmusculus.v75对应 mm10）
• 染色体命名风格一致（例如都用chr1、chr2这样的前缀）

# 获取基因注释信息（静默处理警告和消息）
suppressWarnings({
  suppressMessages({
    annotation <- GetGRangesFromEnsDb(ensdb = EnsDb.Hsapiens.v86)
    seqlevels(annotation) <- paste0('chr', seqlevels(annotation))
    genome(annotation) <- 'hg38'
  })
})

数据读取

本教程提供两种不同形式的数据输入方式，以满足不同用户的数据获取需求，选择适合自己的一种方式即可：

云平台 RDS 文件读取

数据特点：

• RDS 文件是标准的 Seurat 对象文件
• 可直接用于后续的下游分析，也可以提取表达矩阵，重新整合

适用场景：

• 当您无法获得标准的filtered_feature_bc_matrix表达矩阵时
• 希望利用云平台现有数据进行学习时
• 需要快速重新进行基础分析分析时

注意事项：

• 具体挂载数据和 rds 文件的读取，请参照 jupyter 使用教程

例如下列项目数据/home/demo-SeekGene-com/workspace/data/AY1752565399550/

# 例如下列项目数据/home/demo-seekgene-com/workspace/data/AY1752565399550/
#input <- readRDS("/home/demo-seekgene-com/workspace/data/AY1752565399550/input.rds")
#meta <- read.table("/home/demo-seekgene-com/workspace/data/AY1752565399550/meta.tsv", header=TRUE, sep="\t", row.names = 1)


#提取原有rds数据的基因组注释文件
#annotations <- Annotation(input)
#seu <- CreateSeuratObject(counts = input@assay$RNA@counts, meta.data=meta)
#seu[["ATAC"]] <- CreateChromatinAssay(seu, counts = input@assay$ATAC@counts, fragments = input@assay$ATAC@fragments)
#Annotation(seu) <- annotations
#rm(input)
#gc()

标准 filtered_XXXX_bc_matrix 文件读取

适用场景：

• 当您拥有标准的基因表达矩阵和 peaks 开放矩阵文件时
• 希望自主完成单细胞多组学（SeekArc）数据的基础分析时
• 需要进行完整的从原始数据到分析结果的工作流程时

注意：

• 请保证文件结构如下：

数据目录结构需满足如下要求：

1. 样本的文件夹名称为样本 ID，如 S127。
2. 样本文件夹下包含以下文件：
   • filtered_feature_bc_matrix：scRNA-seq 表达矩阵文件夹，包含barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz和matrix.mtx.gz文件。
   • filtered_peaks_bc_matrix：ATAC 的 peak 开放矩阵文件夹，包含barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz和matrix.mtx.gz文件。
   • {样本 ID}_A_fragments.tsv.gz：ATAC 片段文件，如 S127_A_fragments.tsv.gz。
   • {样本 ID}_A_fragments.tsv.gz.tbi：ATAC 片段索引文件，如 S127_A_fragments.tsv.gz.tbi。

具体文件夹结构如下：

├── S127/
│ ├── filtered_feature_bc_matrix/ (scRNA-seq 表达矩阵)
│ │ ├── barcodes.tsv.gz
│ │ ├── features.tsv.gz
│ │ └── matrix.mtx.gz
│ ├── filtered_peaks_bc_matrix/ (ATAC 的 peak 开放矩阵)
│ │ ├── barcodes.tsv.gz
│ │ ├── features.tsv.gz
│ │ └── matrix.mtx.gz
│ ├── S127_A_fragments.tsv.gz (ATAC 片段文件)
│ └── S127_A_fragments.tsv.gz.tbi

# load the RNA and ATAC data
RNA_counts <- Read10X("./S127/filtered_feature_bc_matrix/")
ATAC_counts <- Read10X("./S127/filtered_peaks_bc_matrix/")
fragpath <- "./S127/S127_A_fragments.tsv.gz"

# create a Seurat object containing the RNA adata
seu <- CreateSeuratObject(
  counts = RNA_counts,
  assay = "RNA"
)

# create ATAC assay and add it to the object
seu[["ATAC"]] <- CreateChromatinAssay(
  counts = ATAC_counts,
  sep = c(":", "-"),
  fragments = fragpath,
  annotation = annotation
)

output

Computing hash

数据质量控制

质控指标计算

RNA 质控指标：

• percent.mt: 线粒体基因比例（通常<20%）
• nfeature_RNA: 总 ATAC 特征数（通常在 200-10000 之间）

ATAC 质控指标：

• TSS.enrichment: TSS 富集分数（通常>2）
• nucleosome_signal: 核小体信号（越低越好）
• nCount_ATAC: 总 ATAC 计数（通常在 1000-10000 之间）

# 对每个样本进行质量控制
suppressWarnings({
  suppressMessages({
          # RNA质控指标
          seu[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(seu, pattern = "^MT-")
          # ATAC质控指标
          DefaultAssay(seu) <- "ATAC"
          # 计算TSS富集分数
          seu <- TSSEnrichment(object = seu, fast = FALSE) 
          # 计算核小体信号
          seu <- NucleosomeSignal(object = seu)
  })
})

质控指标可视化

用小提琴图查看各 QC 指标的分布/异常点，确定合适的阈值：

建议：

• 观察是否存在明显的长尾或双峰分布
• 尝试多组阈值并比较下游聚类/UMAP 是否更清晰

# 可视化各质控指标，该cell内容选择性执行，非必要
options(repr.plot.width = 17, repr.plot.height = 10)
suppressWarnings({
  p1=DensityScatter(seu, x = 'nCount_ATAC', y = 'TSS.enrichment', log_x = TRUE, quantiles = TRUE)
  p2=VlnPlot(
      object = seu,
      features = c('nCount_ATAC', 'TSS.enrichment',  'nucleosome_signal',"nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"),
      pt.size = 0.1,
      ncol = 6
  )
 print(p1 / p2)
})

低质量细胞过滤

根据质控指标过滤低质量细胞。具体阈值应根据数据特征进行调整。具体过滤阈值参考上面的小提琴图分布情况。

# 质控过滤
 
cells_before <- ncol(seu)
  
seu <- subset(seu,
    subset = nFeature_RNA > 200 &
             nFeature_RNA < 8000 &
             nCount_RNA > 500 &
             nCount_RNA < 30000 &
             percent.mt < 20 &
             nCount_ATAC > 500 &
             nCount_ATAC < 100000 &
             TSS.enrichment > 1 &
             nucleosome_signal < 2
  )
  
  cells_after <- ncol(seu)

数据标准化处理

RNA 数据标准化和线性降维

标准化方法： 默认情况下，Seurat 采用"LogNormalize"全局缩放标准化方法：

• 首先根据总表达量对每个细胞的特征表达量进行标准化
• 乘以比例因子（默认为 10,000）
• 然后对结果进行对数转换

特征选择： 计算数据集中呈现高细胞间变异性的特征子集（即某些细胞中高表达，而其他细胞中低表达的特征）

数据缩放： 执行线性变换（"scaling"），这是主成分分析（PCA）等降维技术前的标准预处理步骤

降维分析： 对标准化后的数据执行主成分分析（PCA）

suppressWarnings({
  suppressMessages({
      DefaultAssay(seu) <- "RNA"
      seu <- NormalizeData(seu, assay = "RNA")
      seu <- FindVariableFeatures(seu, assay = "RNA", selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
      seu <- ScaleData(seu, assay = "RNA")
      seu <- RunPCA(seu, assay = "RNA", npcs = 50)
      })
    })

ATAC 数据标准化和线性降维

标准化方法： Signac 采用词频-逆文档频率（TF-IDF）标准化方法：

• 在细胞间进行标准化以校正测序深度差异
• 在峰区间进行标准化使稀有峰获得更高权重

特征选择策略： 由于单细胞 ATAC 测序数据的动态范围较低，我们无法像处理单细胞 RNA 测序数据那样直接进行可变特征选择。作为替代方案，可通过 FindTopFeatures()函数选择仅使用前 n%的特征（峰），或剔除在少于 n 个细胞中出现的特征。

降维分析： 随后使用上述筛选的特征（峰）对 TF-IDF 矩阵进行奇异值分解（SVD）。

suppressWarnings({
  suppressMessages({
      seu <- RunTFIDF(seu, assay = "ATAC")
      seu <- FindTopFeatures(seu, assay = "ATAC", min.cutoff = 'q0')
      seu <- RunSVD(seu, assay = "ATAC")
  })
})

非线性降维与聚类

三种聚类策略

1. RNA 聚类：基于基因表达相似性
2. ATAC 聚类：基于染色质可及性相似性
3. WNN 聚类：整合两种模态信息（推荐）

结果解读

• 不同方法可能产生不同的聚类结果
• WNN 聚类通常能发现更细致的细胞亚群
• 建议优先使用 WNN 结果进行下游分析

RNA 降维与聚类

RNA 聚类策略：

• 基于 RNA 数据的独立聚类分析
• 利用基因表达模式进行细胞分类

suppressWarnings({
  suppressMessages({
      seu <- RunUMAP(seu, reduction = "pca", dims = 1:30, assay = "RNA",reduction.name="rnaumap")
      seu <- FindNeighbors(seu, reduction = "pca", dims = 1:30, assay = "RNA",graph.name = "rnaneigobr")
      seu <- FindClusters(seu, resolution = 0.5, algorithm = 1,graph.name = "rnaneigobr")
        })
})

output

Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck

Number of nodes: 12694
Number of edges: 119839

Running Louvain algorithm...n Maximum modularity in 10 random starts: 0.9108
Number of communities: 25
Elapsed time: 0 seconds

ATAC 降维与聚类

ATAC 聚类策略：

• 基于 ATAC 数据的独立聚类分析
• 利用染色质可及性模式进行细胞分类

suppressWarnings({
  suppressMessages({
      seu <- RunUMAP(seu, reduction = "lsi", dims = 1:30, assay = "ATAC",reduction.name="atacumap")
      seu <- FindNeighbors(seu, reduction = "lsi", dims = 1:30, assay = "ATAC",graph.name = "atacneigobr")
      seu <- FindClusters(seu, resolution = 0.5, algorithm = 1,graph.name = "atacneigobr")
        })
})

output

Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck

Number of nodes: 12694
Number of edges: 120530

Running Louvain algorithm...n Maximum modularity in 10 random starts: 0.8927
Number of communities: 19
Elapsed time: 0 seconds

加权最近邻（WNN）分析

WNN 整合聚类策略：

• 结合 RNA 和 ATAC 数据的加权最近邻分析
• 提供更准确的细胞类型识别

suppressWarnings({
  suppressMessages({
      seu <- FindMultiModalNeighbors(seu, reduction.list = list("pca", "lsi"), dims.list = list(1:30, 1:30))
      # 基于WNN进行聚类
      seu <- FindClusters(seu, graph.name = "wknn", resolution = 0.5)
      # WNN UMAP
      seu <- RunUMAP(seu, nn.name = "weighted.nn", reduction.name = "wnn.umap")
        })
})

output

Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck

Number of nodes: 12694
Number of edges: 191058

Running Louvain algorithm...n Maximum modularity in 10 random starts: 0.8993
Number of communities: 20
Elapsed time: 0 seconds

可视化

# 比较不同方法的聚类结果
p1 <- DimPlot(seu, reduction = "rnaumap", group.by = "rnaneigobr_res.0.5",label=T, cols = my36colors) + ggtitle("RNA")
p2 <- DimPlot(seu, reduction = "atacumap", group.by = "atacneigobr_res.0.5",label=T, cols = my36colors) + ggtitle("ATAC")
p3 <- DimPlot(seu, reduction = "wnn.umap", group.by = "wknn_res.0.5",label=T, cols = my36colors) + ggtitle("WNN")

options(repr.plot.width=23, repr.plot.height=6)
print(p1 + p2 + p3)

细胞类型注释

marker 基因

根据组织类型，收集不同细胞类型 marker 基因集，本示例数据是眼睛，下面是眼睛中细胞类型及其对应的 marker 基因，用气泡图可视化不同 cluster 高表达哪些细胞类型的 marker 基因

eye_marker_integrated <- list(
  # ========== 光感受器细胞 ==========
  "Rod_Photoreceptors" = c("RHO", "PDE6B", "CNGB1", "PDE6A", "NR2E3", "REEP6",
                          "RCVRN", "SAG", "NEB", "SLC24A3", "TRPM1"),
  "Cone_Photoreceptors" = c("ARR3", "GNAT2", "OPN1SW", "TRPM3"),

  # ========== 视网膜神经元 ==========
  "Bipolar_Cells" = c("VSX1", "OTX2", "GRM6", "PRKCA",
                     "DLG2", "NRXN3", "RBFOX3", "FSTL4"),
  "Amacrine_Cells" = c("GAD1", "GAD2", "C1QL2", "TFAP2B", "SLC32A1"),
  "Horizontal_Cells" = c("ONECUT1", "LHX1", "CALB1", "NFIA"),
  "Retinal_Ganglion_Cells" = c("RBPMS", "THY1", "NEFL", "POU4F2"),

  # ========== 胶质细胞 ==========
  "Muller_Glia" = c("SLC1A3", "RLBP1", "SOX9", "CRYAB"),
  "Astrocytes" = c("GFAP", "AQP4", "S100B"),
  "Microglia" = c("TMEM119", "C1QA", "AIF1", "CX3CR1", "CD74",
                 "PTPRC", "CSF1R", "CCL3L1", "SPP1", "P2RY12"),

  # ========== 血管与支持细胞 ==========
  "Endothelial" = c("FLT1", "PODXL", "PLVAP", "KDR", "EGFL7",
                   "CLDN5", "PECAM1", "CDH5"),
  "Pericytes" = c("PDGFRB", "RGS5", "CSPG4", "STAB1"),

  # ========== 上皮细胞 ==========
  "RPE" = c("RPE65", "BEST1", "PMEL", "TYRP1", "DCT", "SLC38A11"),
  #"Corneal_Epithelial" = c("KRT12", "KRT3"),
  "Corneal_Endothelial" = c("SLC4A11", "COL8A2", "ATP1A1"),
  "Conjunctival_Epithelial" = c("KRT13", "KRT19", "MUC5AC"),
  "Retinal_Progenitors" = c("VSX2", "PAX6","SOX2", "HES1", "NOTCH1"),  # 神经视网膜增殖期

  # ========== 晶状体细胞 ==========
  "Lens_Epithelial" = c("CRYAA", "BFSP1", "MIP"),
  "Lens_Fiber" = c("CRYGS", "LIM2", "FN1"),

  # ========== 其他细胞 ==========
  "Melanocytes" = c("TYR", "MLANA", "MITF"),
  #"Erythrocytes" = c("HBB", "HBA1", "HBA2"),
  "ECM" = c("COL1A1", "COL3A1", "COL12A1", "COL1A2", "COL6A3")#,
  #"Others" = c("TTN", "CLCN5", "DCC", "MIAT")
)

# 设置图形大小
options(repr.plot.width=25, repr.plot.height=7)

# 绘制DotPlot
DefaultAssay(seu)="RNA"
DotPlot(seu, 
        group.by = "wknn_res.0.5", 
        features = eye_marker_integrated,
        cols = c("#f8f8f8","#ff3472"),
       #dot.min = 0.05,
       dot.scale = 8)+  # 应用自定义配色
  RotatedAxis() + 
  scale_x_discrete("") + 
  scale_y_discrete("") +
  theme(
    axis.text.x = element_text(size = 12, face = "bold", 
                              angle = 45, hjust = 1, vjust = 1),
    axis.text.y = element_text(size = 12, face = "bold"),
    plot.title = element_text(size = 14, face = "bold", hjust = 0.5),
    legend.title = element_text(size = 10, face = "bold")
  ) +
  ggtitle("Marker Genes Expression") +
  labs(color = "Expression\nLevel")  # 修改图例标题

output

Warning message:
"The \`facets\` argument of \`facet_grid()\` is deprecated as of ggplot2 2.2.0.
ℹ Please use the \`rows\` argument instead.
ℹ The deprecated feature was likely used in the Seurat package.
Please report the issue at ."

** 注意事项 ** SeekArc 单细胞双组学数据细胞注释一般基于 wnn 多模态降维，依据 marker 基因在 wknn 聚类结果中表达情况进行注释

options(repr.plot.width=10, repr.plot.height=8)
DimPlot(seu, reduction = "wnn.umap", group.by = "wknn_res.0.5", cols = my36colors,label = T)

细胞类型标注

cat('开始细胞类型注释...', Sys.time(), '\n')

# 基于聚类结果进行细胞类型注释（需要根据实际的marker基因表达情况调整）
# 这里提供一个示例，实际使用时需要根据DotPlot结果进行调整
celltype_mapping <- c(
  "0" = "Retinal_Progenitors",
  "1" = "ECM",
  "2" = "PRE",
  "3" = "ECM",
  "4" = "ECM",
  "5" = "ECM",
  "6" = "Bipolar_Cells",
  "7" = "ECM",
  "8" = "ECM",
  "9" = "ECM",
  "10" = "ECM",
  "11" = "Bipolar_Cells",
  "12" = "Bipolar_Cells",
  "13" = "Endothelial",
  "14" = "Conjunctival_Epithelial",
  "15" = "Astrocytes",
  "16" = "Muller_Glia",
  "17" = "Rod_Photoreceptors",
  "18" = "Microglia",
  "19" = "Lens"
)

# 应用细胞类型注释
seu$celltype <- recode(
  seu$wknn_res.0.5,
  !!!celltype_mapping
)

output

开始细胞类型注释... 1755579264

注释结果可视化

cat('细胞类型注释可视化...', '\n')

# 细胞类型UMAP可视化
p1 <- DimPlot(
  seu,
  reduction = "wnn.umap",
  group.by = "celltype",
  label = TRUE,
  label.size = 3,
  cols = my36colors
) +
  ggtitle("celltype") +
  theme(legend.position = "bottom")

# 保存细胞类型注释图
pdf("celltype_annotation.pdf", width = 16, height = 12)
print(p1)
dev.off()
options(repr.plot.width=10, repr.plot.height=8)
print(p1)

output

细胞类型注释可视化...

pdf: 2

保存结果

# 保存整合后的Seurat对象
saveRDS(seu, file = "processed.rds")

总结

本教程演示了单细胞多组学数据的单样本分析流程。

后续分析方向

• 细胞类型注释和标记基因识别
• 差异表达和差异可及性分析
• genes 和 peaks 的共可及性分析
• Motif 分析
• 足迹分析
• 基因调控网络推断
• 发育轨迹和伪时间分析
• 拷贝数变异分析
• 表观性状与 ATAC 联合分析

sessionInfo()

output

R version 4.3.3 (2024-02-29)
Platform: x86_64-conda-linux-gnu (64-bit)
Running under: Debian GNU/Linux 12 (bookworm)

Matrix products: default
BLAS/LAPACK: /jp_envs/envs/common/lib/libopenblasp-r0.3.29.so; LAPACK version 3.12.0

locale:
[1] LC_CTYPE=C.UTF-8 LC_NUMERIC=C LC_TIME=C.UTF-8
[4] LC_COLLATE=C.UTF-8 LC_MONETARY=C.UTF-8 LC_MESSAGES=C.UTF-8
[7] LC_PAPER=C.UTF-8 LC_NAME=C LC_ADDRESS=C
[10] LC_TELEPHONE=C LC_MEASUREMENT=C.UTF-8 LC_IDENTIFICATION=C

time zone: Asia/Shanghai
tzcode source: system (glibc)

attached base packages:
[1] stats4 stats graphics grDevices utils datasets methods
[8] base

other attached packages:
[1] future_1.40.0 harmony_1.2.3
[3] Rcpp_1.0.14 patchwork_1.3.0
[5] ggplot2_3.5.2 dplyr_1.1.4
[7] biovizBase_1.50.0 BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg38_1.4.5
[9] BSgenome_1.70.1 rtracklayer_1.62.0
[11] BiocIO_1.12.0 Biostrings_2.70.1
[13] XVector_0.42.0 EnsDb.Hsapiens.v86_2.99.0
[15] ensembldb_2.26.0 AnnotationFilter_1.26.0
[17] GenomicFeatures_1.54.1 AnnotationDbi_1.64.1
[19] Biobase_2.62.0 GenomicRanges_1.54.1
[21] GenomeInfoDb_1.38.1 IRanges_2.36.0
[23] S4Vectors_0.40.2 BiocGenerics_0.48.1
[25] Signac_1.10.0 SeuratObject_4.1.4
[27] Seurat_4.4.0

loaded via a namespace (and not attached):
[1] ProtGenerics_1.34.0 matrixStats_1.5.0
[3] spatstat.sparse_3.1-0 bitops_1.0-9
[5] httr_1.4.7 RColorBrewer_1.1-3
[7] repr_1.1.7 tools_4.3.3
[9] sctransform_0.4.1 backports_1.5.0
[11] R6_2.6.1 lazyeval_0.2.2
[13] uwot_0.2.3 withr_3.0.2
[15] sp_2.2-0 prettyunits_1.2.0
[17] gridExtra_2.3 progressr_0.15.1
[19] cli_3.6.4 Cairo_1.6-2
[21] spatstat.explore_3.4-2 labeling_0.4.3
[23] spatstat.data_3.1-6 ggridges_0.5.6
[25] pbapply_1.7-2 Rsamtools_2.18.0
[27] pbdZMQ_0.3-13 foreign_0.8-87
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