单细胞空间转录组：H&E 与 DAPI 图像配准操作指南
简介
在空间转录组学 (Spatial Transcriptomics) 以及多模态图像分析的工作流程中，研究人员通常会从连续的相邻组织切片中获取不同维度的信息。特别是在寻因生物 (SeekGene) 的单细胞空间转录组技术中，基因表达量数据是基于含有荧光信号的 DAPI 染色切片进行捕获和定位的；而为了获得更清晰的病理学组织形态参考，高分辨率的 H&E 明场图像通常需要从其相邻的切片中获取。
由于切片在切片机上的放置、物理形变以及不同成像平台的视场差异，这些相邻切片的图像往往在空间坐标上无法天然重合。为了在后续的数据分析中（如细胞分割、聚类注释）能够准确地将空间转录组的基因表达数据映射到 H&E 图像高分辨率的组织学特征上，图像配准 (Image Registration) 是一个不可或缺的关键步骤。
本教程提供了一套标准化的手动操作流程，指导您如何使用开源且功能强大的图像编辑软件 GIMP，将 H&E 明场图像与 DAPI 荧光图像进行高精度的空间对齐。通过本教程，您将掌握图像的预处理、图层叠加、空间变换 (缩放、移动、旋转) 以及背景修复等核心技巧。
准备工作
在开始执行配准流程之前，请确保您已经准备好以下运行环境与数据文件：
- 软件环境要求：
- 请下载并安装 GIMP 2.10.36 版本 (GNU Image Manipulation Program)。GIMP 支持 Windows、macOS 和 Linux 操作系统，建议在配置较高（尤其是内存充足）的计算机上运行，以应对高分辨率医疗图像的处理需求。
- 输入图像数据：
- DAPI 荧光图像 (
.tiff或其他兼容格式)：作为空间转录组数据的物理坐标参考。该图像可以是显微镜直接导出的原始扫描切片，也可以是已经过 SeekSpace® Tools 等上游管线处理、并与表达量矩阵完成配准的中间产物图像。 - H&E 染色图像 (
.tiff)：由明场显微镜扫描获取的高分辨率切片图像。请注意，这类医疗影像文件通常包含多个不同分辨率的金字塔图层（Pyramidal TIFF），本教程将指导您如何正确提取所需的最高分辨率图层。
- DAPI 荧光图像 (
原始 DAPI 染色图像切片处理
原始的 DAPI 荧光图像通常包含大量的无用背景或黑边，且图像的长宽比例可能与空间芯片的实际物理尺寸不符。在此阶段，我们将对原始 DAPI 图像进行方向校正和标准化裁剪，使其精确匹配空间转录组芯片的有效区域。
TIP
流程适用性提示：本阶段的操作不仅是 H&E 配准的前置准备，它同样也是 SeekSpace® Tools DAPI 输入文件的标准预处理流程。如果您需要将显微镜导出的原始 DAPI 图像输入到 SeekSpace® Tools 中进行分析，也可以完全遵循此阶段的步骤进行裁剪和处理。
跳过条件：如果您的 DAPI 图像已经是经过 SeekSpace® Tools 处理并完成表达量配准的图像，请直接跳过此阶段，进入H&E 与 DAPI 图像精细配准。
导入 DAPI 图像
打开 GIMP 软件。通过菜单栏选择 File > Open...，或在文件资源管理器中选中目标 DAPI 图像，直接将其拖拽到 GIMP 的工作区中完成导入。导入后，您将看到包含完整扫描视场的原始荧光图像。
校正图像方向
显微镜扫描时切片的放置方向可能各不相同。为了便于后续的参考线标记和标准化裁剪，我们需要首先将芯片调整为标准的水平方向。
- 观察图像中的组织和芯片轮廓，若方向不正确，在菜单栏中选择相应的旋转操作，例如：Image > Transform > Rotate 90° counter-clockwise（逆时针旋转 90 度）。
- 确保切片的组织方向与芯片的预期长宽走向一致，这对于后续按照固定比例进行裁剪至关重要。
添加参考线标记边界
为了确保裁剪的精准度，避免手动框选时的视觉误差，我们需要利用 GIMP 的参考线功能来严密标记空间芯片的有效边缘 (即包含空间 Barcode 的荧光区域边界)。
- 将鼠标移动到工作区上方（水平标尺）或左侧（垂直标尺）的标尺区域。
- 按住鼠标左键，向图像内部拖拽，即可拉出一条水平或垂直的参考线（如下图红色箭头指示）。
- 仔细观察图像，将参考线精准放置在有荧光信号的芯片有效捕获区边缘（如下图蓝色箭头指示）。
TIP
参考线放置建议：通常建议仅标记芯片的上边缘、下边缘以及左侧边缘。保留右侧或不规则边缘开放，这样可以在下一步中利用固定长宽比自动约束右侧边界，确保整体裁剪比例不失真。完成参考线布置后的效果如下：
按照固定比例裁剪
寻因生物单细胞空间转录组芯片具有特定的物理尺寸长宽比。为了保证图像坐标与实际芯片坐标的完美映射，必须按照固定比例进行裁剪。
- 点击左侧工具栏中的 裁剪工具 (Crop Tool)，或使用快捷键
Shift + C。 - 在左侧的工具选项 (Tool Options) 面板中，勾选 Fixed (固定比例)，并在下方的输入框中设置标准的芯片长宽比为
2.765:1。 - 将鼠标光标移动到左侧水平和垂直参考线交汇的顶点处（红色箭头所示），点击并向右下方拖拽生成裁剪框。得益于参考线的吸附功能，裁剪框的起始点会完美贴合边缘。
- 确认裁剪框已经覆盖了有效的组织区域后，按
Enter键或在选区内部双击以完成裁剪操作。
WARNING
边缘溢出处理：在拖拽生成裁剪框时，如果发现裁剪框的右侧边缘超出了原始图像边界（如下方图像中红色箭头所示），说明水平参考线可能标记得过宽，请将两条水平参考线向图像中间微调（如下方图像中蓝色箭头所示的方向）；反之，如果裁剪框未能完全包裹住右侧的组织，请将水平参考线向图像外侧微调。调整参考线后，重新拉出裁剪框进行尝试。
导出预处理图像
完成方向校正和标准化裁剪后，我们需要将这张处理好的 DAPI 图像保存下来，以便用于下一步的 H&E 配准或作为 SeekSpace® Tools 的输入。
- 依次点击菜单栏的 File > Export As...。
- 在弹出的对话框中，将文件格式设置为
.tiff（推荐使用无损格式保留荧光细节），输入合适的文件名，选择保存路径后点击导出。
H&E 与 DAPI 图像精细配准
在此阶段，我们将以预处理完成的 DAPI 荧光图像为空间坐标基准，将包含高分辨率形态学信息的 H&E 明场图像与之进行精确的叠加和对齐。这是空间转录组数据分析中最核心的一步，直接关系到后续基因表达数据映射的准确性。
导入 H&E 与 DAPI 图像层
- 首先将原始的 H&E 染色明场图像文件拖拽至 GIMP 工作区。由于高分辨率的显微镜扫描文件通常包含多个不同分辨率级别的金字塔图层 (Pyramidal layers)，在弹出的导入提示框中，请务必仅选择 第一层 (Page 1)，以确保导入的是最高分辨率的全尺寸明场图像。
- H&E 图像成功加载后，将阶段一中裁剪预处理好的 DAPI
.tiff图像也直接拖拽到 GIMP 的同一工作区中。此时，DAPI 图像会自动作为一个全新的独立图层，叠加在原有的 H&E 图像之上，形成多图层的工作状态。
图层置换与透明度设置
为了能够同时看清两层图像的重合关系并进行精准对齐，我们需要调整图层的上下顺序和透明度。
- 在 GIMP 界面右下角的 图层面板 (Layers) 中，您可以清楚地看到目前加载的两个图层。为了符合“以 DAPI 为底图参考，调整 H&E”的操作逻辑，请用鼠标拖拽图层来调整它们的层级顺序，确保 H&E 图层位于最上方，DAPI 图层位于最下方。
- 选中位于上方的 H&E 图层，将其在图层面板上方对应的 Opacity (不透明度) 滑块向左拉动，降低至 20% 左右。您可以根据 H&E 切片的实际染色深浅进行微调，直到您能够清晰地透过上层暗淡的 H&E 组织，观察到下方 DAPI 图像明亮的荧光轮廓为止。
图像空间变换（移动、缩放与旋转）
在调整好透明度后，您需要通过移动、缩放和旋转操作将两层图像的形态特征完全对齐。
TIP
操作指南：以下三种操作 (缩放、移动、旋转) 没有绝对严格的先后顺序要求。不过，在实际操作中，为了提高配准效率，通常建议遵循“先缩放 (粗调尺寸)、再移动 (对齐位置)、后旋转 (校准角度)”的顺序作为起始步骤。由于切片形变的复杂性，在完成一轮初步调整后，您往往还需要根据图像的具体重合情况，交替、多次重复使用这些工具，逐步逼近最佳的对齐效果，直到两张切片的整体轮廓和主要组织结构达到一个令人满意的匹配水平。
- 缩放 (Scale)：首先，在图层面板中务必选中 DAPI 图层。接着，在左侧工具栏中选择 缩放工具 (Scale Tool)，或使用快捷键
Shift + S。在左侧的工具选项面板中，确保保持长宽比锁定（点击链条图标使其闭合，或勾选保持比例）。然后点击画面激活缩放网格，拖拽网格边缘进行同比例拉伸或压缩，使 DAPI 图像的整体尺寸大致等同于上方的 H&E 组织大小。调整完毕后按Enter键确认应用。
WARNING
重要提示：在整个配准的缩放过程中，只能对 DAPI 图像进行缩放操作。绝对不要对 H&E 明场图像进行缩放，否则会导致高分辨率的 H&E 图像发生严重的像素插值和精度损失。
- 移动 (Move)：在工具栏中选择 移动工具 (Move Tool)，或使用快捷键
M。在图层面板中选中需要移动的图层，按住鼠标左键在画布上自由拖拽，将两层图像中组织的主要解剖结构（如明显的组织外轮廓、特殊的空洞或大型血管）进行初步的对齐与重合。
- 旋转 (Rotate)：如果两张相邻切片在切片机上放置的角度存在轻微偏差，则需要进行旋转校准。在工具栏中选择 旋转工具 (Rotate Tool)，或使用快捷键
Shift + R。首先，在左侧的工具选项面板中，务必将 Interpolation (插值算法) 设置为Cubic（三次多项式插值）。在图层面板中选中 H&E 图层，点击画面，在弹出的控制面板中细微输入旋转角度 (Angle)，或者直接用鼠标拖拽图像的边角进行手动旋转。仔细观察两层图像的组织边缘和主要脉络走向，直至它们达到最完美的吻合。
WARNING
重要提示：只能对 H&E 图像进行旋转操作。请注意，每次旋转都会对图像像素进行重新插值计算，因此请尽可能减少旋转的执行次数（最好在弹出的面板中不断调整角度直到完美后，再一次性点击确认），以最大程度地保留 H&E 图像的原始精度。
高级缩放与局部特征对齐（选做）
由于切片在制备过程中不可避免地会发生轻微的物理形变（如局部拉伸或收缩），仅仅依靠整体的等比例缩放和旋转，往往难以让所有区域都完美对齐。
- 再次使用 缩放工具 (Scale Tool) 选中底部的 DAPI 图层，此时可以取消等比例锁定（解锁长宽比限制）。
- 针对那些重合度较差的局部区域，单独向各个方向拉伸或压缩 DAPI 图像的边缘。在此过程中，请密切观察组织内部的核心特征点（如特定血管的横截面、明显的细胞簇或组织空洞边缘）的贴合情况，通过反复微调实现亚像素级别的精细对齐。
TIP
对齐效果对比：通过这种非等比例的局部微调，可以明显消除组织内部及边缘的重影和错位现象，大幅提升空间转录组数据的映射精度。
修复画布尺寸与背景
- 适配画布：在经历了多次的移动、缩放和旋转操作后，两张图像的边界很可能已经超出了当前画布的可视范围，或者在画布边缘留下了空白区域。点击菜单栏的 Image > Fit Canvas to Layers（将画布适配至图层），GIMP 会自动扩展画布尺寸，确保所有的图像信息都被完整包含在可视工作区内。
- 填充前景色（替换 DAPI 图层）：此时由于画布扩大，DAPI 图像的周围可能会出现透明的棋盘格区域。需要特别说明的是：在这一步，DAPI 图像仅仅是作为对齐 H&E 的“空间坐标脚手架”，一旦空间对齐完成，我们就不再需要保留 DAPI 的原始荧光图像了，我们需要将其替换为纯白背景，以配合 H&E 的明场底色。请在图层面板中选中底部的 DAPI 图层，确保左侧工具栏的前景色设置为纯白色。在工具栏中选择 油漆桶工具 (Bucket Fill Tool)，或使用快捷键
Shift + B，直接在画面上点击，将整个 DAPI 图层连同其周围的透明区域全部填充为纯白色。这能保证最终合并后的图像具有与 H&E 图像一致的干净白色背景。
合并图层与最终导出
- 恢复透明度与合并：在进行最终的合并之前，请务必先在图层面板中选中上方的 H&E 图层，并将其 Opacity (不透明度) 从之前的 20% 重新拉回至 100%，恢复其原本的鲜亮色彩。确认两层图像（现为 100% 不透明的 H&E 和下方的纯白背景）完全符合预期后，在图层面板中右键点击任意图层，选择 Merge Visible Layers... (合并可见图层)，在弹出的对话框中点击 Merge，将多图层结构融合成单一的图像平面。
- 导出复合图像：依次点击菜单栏的 File > Export As...。在弹出的导出窗口中，选择合适的文件路径并命名，将这张高精度配准好的、带有纯白背景的 H&E 复合图像导出为
.tiff格式，以保留最高的图像质量供后续分析使用。至此，整个相邻组织切片的配准流程圆满完成。
H&E 图像组织提取与背景纯白化（选做）
TIP
应用场景：如果您计划在后续使用配准后的 H&E 图像进行超分辨率重建或其他对背景敏感的高级分析，原始扫描图像中自带的浅色背景（如载玻片的玻璃底色或扫描仪的光照不均）可能会干扰算法的判断。本阶段将指导您将真正的组织结构提取出来，并将原始背景完全替换为我们在阶段二中创建的绝对纯白背景。
官方教程链接：如果您想了解更多关于 GIMP 中模糊选择工具（魔棒）和背景提取的高级技巧，可以参考 GIMP 官方用户手册：模糊选择工具。
- 添加透明通道：在图层面板中，右键点击上方的 H&E 图层，选择 Add Alpha Channel (添加透明通道)。如果该选项呈灰色，说明图层已包含透明通道。
- 选择背景区域：在左侧工具栏中选择 模糊选择工具 (Fuzzy Select Tool)（快捷键
U）。 - 调整阈值并选中背景：
- 在左侧的工具选项中，找到 Threshold (阈值) 滑块（建议初始值设为 15-30）。
- 建议勾选 Feather edges (羽化边缘) 并设置半径为 1-2，这能让提取的组织边缘过渡更自然。
- 在 H&E 图像外围的原始浅色背景上点击鼠标左键。GIMP 会自动选中颜色相近的连续背景区域。如果选区不理想（选得太少或侵入了组织内部），请按
Ctrl + Z撤销，调整阈值后重新点击。
- 一键提取组织：确认选区（闪烁的蚂蚁线）主要包裹了不需要的背景后，按下键盘上的
Delete键。原有的浅色背景将被彻底删除并变为透明，下方图层（我们在阶段二中填充的绝对纯白背景）将完美透视出来，从而实现真正的“背景纯白化”。 - 取消选区：点击菜单栏的 Select > None (选择 > 无) 或使用快捷键
Ctrl + Shift + A取消蚂蚁线选区。放大图像边缘检查提取效果。完成后，请返回阶段二的 合并图层与最终导出 步骤完成图像保存。
