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单细胞 scATAC-seq & scRNA-seq 双组学标准分析：Motif 分析 ​

作者: SeekGene
时长: 13 分钟
字数: 3.3k 字
更新: 2025-11-17
阅读: 0 次

文档概述 ​

Motif 分析是解析单细胞 ATAC-seq 数据中转录因子调控网络的重要关节。常见分析策略包括：在差异可及性 peak 集合中挖掘富集的 motif，以及对不同细胞群体间进行 motif 活性差异分析。本文档将系统阐述 motif 的基本概念、差异可及性 peak 集合的motif 富集分析方法、motif 活性差异分析。

一、核心概念：什么是 Motif？ ​

(1) Motif 的定义 ​

转录因子需要与DNA开放区域（peaks）结合才能发挥调控作用，每个转录因子通常有偏好的结合序列（如 SP1 偏好 GC 富集序列），这些序列模式就是 Motif，因此可以将Motif（基序）理解为转录因子结合位点的 DNA 序列模式，通常由 6-20 个碱基对组成。如下所示：

(2) Motif 数据库 ​

到目前为止，已经有多个权威数据库整合并完善了不同物种的motif信息，为后续的分析提供了结构化、全面的数据资源。常用的 motif 数据库包括：JASPAR 数据库、HOMER、MEME Suite、TRANSFAC，其中JASPAR 数据库是最常用的转录因子结合位点数据库，包含多个物种的 motif。

TIP

早期对 motif 的确定主要依赖于实验手段（如ChIP-seq、SELEX等）或生物信息学预测，得到的是零散且有限的转录因子结合序列。随着研究深入和大量实验数据的积累，motif 信息不断丰富和标准化。Motif的信息已经相对较健全，直接通过各个数据库就能查阅到对应物种的motif信息。

二、Motif 富集分析 ​

(1) 什么是 Motif 富集？ ​

Motif 富集是指统计特定基因组区域中(如差异peaks)，每种特定 motif 出现的频率，并与背景 peaks（如全体 peaks 或 matched control）中的频率进行比较。如果某个 motif 在差异 peaks 中的出现频率显著高于背景，就认为该 motif 在这些区域“富集”。

简单来说，就是统计某些区域（如差异 peaks）里某个 motif 出现了多少次，再和背景区域对比，如果在差异 peaks 里出现得更多，就认为这个 motif 富集

有如下应用：

  • 比较不同细胞类型或状态的 peaks 开放程度，筛选出某一类型或状态中特异性开放的 peaks，进而分析其富集的 motif，推测对应的关键调控因子。
  • 针对差异 peaks（如疾病组 vs 对照组），进行 motif 富集分析，挖掘调控异常相关的 TF，辅助生物学机制解释和功能归因。

TIP

想要更加直观地理解 对差异peaks进行Motif 富集分析的应用，可以参考实际案例，查阅关于单细胞双组学数据中差异 peak 的 Motif 富集分析部分，详见《单细胞ATAC_RNA多组学差异peaks分析》。

(2) Motif 富集分析的实现： ​

以Signac为例， Signac使用 AddMotifs() 函数将 motif 信息添加到 Seurat 对象，并用 FindMotifs() 进行 motif 富集分析。下面是关键代码示例（以人类、hg38 为例）：

r
library(Signac)
library(JASPAR2022)
library(TFBSTools)

# 1. 载入 motif 数据库（以人物种为例）
pfm <- getMatrixSet(
  x = JASPAR2020,
  opts = list(collection = "CORE", tax_group = "vertebrates", all_versions = FALSE)
)

# 2. 添加 motif 信息到 ATAC 对象（例如atac）
DefaultAssay(obj) <- "ATAC"
obj <- AddMotifs(
  object = obj,                  # 你的Seurat/Signac对象
  genome = BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg38, # 注意加载合适的基因组包
  pfm = pfm
)

# 3. 对感兴趣的peaks进行motif富集分析，使用obj中的全部peaks作为背景peaks
motif.results <- FindMotifs(
  object = obj,
  features = diff_peak    # 例如差异分析得到的差异peaks列表
)

head(motif.results)
motifobservedbackgroundpct.obspct.bkgfold.enrichpvaluemotif.namep.adjust
MA0497.1556831549.1620.792.3650MEF2C0
MA0052.4533794847.1319.872.3720MEF2A0
MA0773.1398493035.1912.332.8550MEF2D0
MA0660.1345400230.5010.013.0490MEF2B0
MA1151.1286320625.298.023.1550RORC0
MA0592.3350466930.9511.672.6510MEF2A0

motif：motif 在数据库中的编号，通常代表一个特定的转录因子的结合序列。
observed：在目标 peaks（如差异 peaks）中包含该 motif 的数量。
background：在背景 peaks（对照组或全部 peaks）中包含该 motif 的数量。
pct.obs：目标 peaks 中带有该 motif 的百分比（= observed/目标 peaks 总数 × 100%）。
pct.bkg：背景 peaks 中带有该 motif 的百分比（= background/背景 peaks 总数 × 100%）。
fold.enrich：motif 在目标 peaks 中的富集倍数，= pct.obs / pct.bkg，数值越大表明 motif 在差异 peaks 中越富集。
pvalue：motif 富集分析的统计显著性原始 P 值，越小意味着富集不太可能是随机出现的。 motif.name：motif 对应的转录因子名称，便于直观识别调控因子。
p.adjust：多重假设检验校正后的 P 值（如 FDR 校正），p.adjust < 0.05 常被认为是显著富集。

通过上述指标，可以判定哪些 motif（及其对应转录因子）在差异 peaks 中显著且强烈富集，从而揭示可能参与调控的关键 TF。

TIP

背景peaks:

  • 是指在motif富集分析中用作对照的一组peaks，通常代表全体peaks或无显著差异的peaks。其作用是为感兴趣peaks（如差异peaks）中某一motif的出现频率提供一个基准。
  • 通过比较差异peaks与背景peaks中某motif的富集程度，可以判断该motif是否在特定生物学状态下有显著富集。
  • FindMotif()函数通过background参数可以提供一个特征向量作为背景集，或者提供一个数字来指定随机选择的特征数量作为背景集。

三、Motif 活性分析 ​

(1) 什么是 Motif 活性？ ​

  • Motif 活性（Motif Activity）是衡量某个转录因子的 motif 在特定细胞中的潜在结合和调控能力的指标。
  • 与 Motif 富集分析不同，motif 活性不是简单地统计 motif 出现的次数，而是考虑该细胞中哪些 peak 含有该 motif，以及这些 peak 的开放程度。

(2) Motif 活性的计算 ​

以 Signac 为例，motif 活性分析的主要流程与 R 代码如下：

r
library(Signac)
library(Seurat)
library(JASPAR2022)
library(TFBSTools)
library(BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg38) # 或根据你的物种调整

# 获取 motif 数据集
pfm <- getMatrixSet(
  x = JASPAR2022,
  opts = list(collection = "CORE", tax_group = "vertebrates")
)

# 将 motif 信息添加到 ATAC 对象（假设对象名为 obj，Assay 名为 ATAC）
obj <- AddMotifs(
  object = obj,
  genome = BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg38,
  pfm = pfm
)

# 运行 chromVAR 计算 motif 活性
obj <- RunChromVAR(
  object = obj,
  genome = BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg38
)

查看 motif 活性结果

  • 运行完成后，会在对象中新增一个名为 "chromvar" 的 Assay。可以用 Seurat 的 FeaturePlot可视化 motif 活性。
  • 例如，可将特定 motif 的活性在 UMAP 上可视化：
r
FeaturePlot(obj, features = "MA0497.1", assay = "chromvar")
  • Motif 活性分数解读
  • 偏差分数为正值：该 motif 在该细胞中活跃，TF 可能功能活跃。
  • 偏差分数为负值：该 motif 在该细胞中不活跃或受抑制。
  • 偏差分数接近零：活性与背景无显著差异。

WARNING

注意事项

  • 计算 motif 活性时建议使用合适物种的基因组版本。
  • motif 数量或细胞数多时分析耗时较长，可结合并行加速。

四、Motif活性的差异分析 ​

在前文我们介绍了如何在单细胞水平计算每个 motif 的活性分数（chromVAR 偏差分数）。有了这些 motif 活性分数矩阵后，接下来我们常常希望比较不同细胞类型或状态之间，哪些 motif 的活性存在显著差异，从而进一步推断关键转录因子。

直接进行Motif活性差异分析（Differential Motif Activity） ​

相比只基于差异peak进行的motif富集分析，直接比较细胞类别间的motif活性差异，结果通常具有高度一致性，并且能反映更直观的调控活跃程度。

以 Signac/Seurat 分析框架为例，可以利用 FindMarkers()、FindAllMarkers() 函数直接对 chromVAR 得到的 z-score（即 motif 活性矩阵中的值）进行两组/两类细胞之间的差异分析。此时，常用如下参数来获得“不同类别平均z-score之差”：

r
differential.activity <- FindMarkers(
  object = obj,
  ident.1 = 'Pvalb',#比较‘Pvalb’ 与 ‘Sst’ 两组细胞的 motif 活性差异
  ident.2 = 'Sst',
  only.pos = TRUE,
  mean.fxn = rowMeans,
  fc.name = "avg_diff"
)

TIP

  • FindAllMarkers() 适用于一次性自动比较每个细胞群体与所有其他群体的差异 peaks，非常适合多组分群（如多个细胞类型或状态）的全面差异分析。
  • FindMarkers() 适用于两组之间的直接对比（如疾病组 vs 对照组），可实现灵活的一对一差异 peaks 筛查，更便于特定分组之间的精确比较。

获得差异 motif 后，可用 MotifPlot 对显著 motif 进行可视化：

r
MotifPlot(
  object = obj,
  motifs = head(rownames(differential.activity)),
  assay = 'peaks'
)

五、Motif活性解读 ​

在多组学数据中，可以同时检查：Motif 活性（ATAC 数据）和TF 表达（RNA 数据）

（1）Motif 活性与 TF 表达一致： ​

理想情况下，如果某个转录因子在某细胞类型中活跃，其 motif 活性应该高，其 RNA 表达也应该高。

（2）Motif 活性与 TF 表达不一致： ​

  1. motif 活性高但 TF 表达低，可能原因:
  • 转录因子以非表达依赖的方式调控（如通过共激活因子）
  • 转录因子在蛋白水平存在但 RNA 水平较低
  • 其他转录因子共享相同的 motif
  1. TF 表达高但 motif 活性低，可能原因:
  • 转录因子可能结合在其他区域（非 peak 区域）
  • 转录因子可能以不依赖 DNA 结合的方式起作用

TIP

关键转录因子的识别：

  • 在多组学数据中，应重点关注 motif 活性和 TF 表达均高的转录因子。
  • 这类 TF 通常是“组合证据”支持的核心调控因子，既具备较强的结合潜能（motif 活性），也有明确的表达（RNA），同时可能直接调控相关Target基因（peak-gene 关联）。

六、Motif 分析的生物学应用 ​

(1) 细胞类型特异性调控因子 ​

识别细胞类型标记 TF：

  • 通过比较不同细胞类型的 motif 活性，可以识别每种细胞类型特异的转录因子。
  • 这些 TF 可以作为细胞类型的调控标记，类似于基因表达层面的 marker 基因。
  • 例如，SPI1/PU.1 是小胶质细胞的标记转录因子；PAX5 是 B 细胞的标记转录因子。

(2) 疾病相关的调控异常 ​

疾病样本中的 Motif 活性异常：

  • 比较疾病样本与对照样本的 motif 活性，可以识别哪些转录因子的调控出现异常。
  • 这些异常可能提示疾病的调控机制或潜在的治疗靶点。
  • 例如，在阿尔茨海默病中，某些转录因子（如 ZEB1、MAFB）的 motif 活性可能异常。

(3) 多组学数据的优势 ​

RNA-ATAC 整合验证：

  • 在多组学数据中，可以同时检查：

    1. Motif 活性（来自 ATAC）：反映转录因子的潜在结合能力。
    2. TF 表达（来自 RNA）：反映转录因子的实际表达水平。

  • 如果某个转录因子的 motif 活性高且表达也高，说明该 TF 在该细胞中活跃且参与调控。

    TIP

    三证合一的调控分析：

    • Peak-Gene-TF Trio 分析：
      1. 识别差异开放的 peak（差异 peak 分析）。
      2. 关联 peak 到附近基因（基因注释）。
      3. 识别 peak 中富集的 motif（motif 分析）。
      4. 验证 TF 表达与 peak 开放、基因表达的相关性（多组学整合）。
    • 通过三证合一，可以更可靠地识别关键转录因子和调控机制。

七、常见问题 ​

Q1：Motif 活性与 Motif 富集有什么区别？

A：两者相关但不同：

  • Motif 富集：

    • 关注点：特定 peak 集合（如差异 peak）中哪些 motif 显著富集。
    • 方法：统计 motif 在目标 peak 集合中的出现频率，与背景比较。
    • 结果：得到一个 motif 富集列表，说明哪些 TF 可能调控这些 peak。
    • 应用：通常用于差异 peak 分析后的功能解释。

  • Motif 活性：

    • 关注点：每个细胞中每个 motif 的活性水平。
    • 方法：考虑该细胞中包含该 motif 的 peak 的开放程度，计算偏差分数。
    • 结果：得到一个细胞 × motif 的活性矩阵。
    • 应用：可以用于细胞聚类、识别细胞类型特异的 TF、分析 TF 活性的动态变化。
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