基础分析

作者: 高瑞峰

时长: 8 分钟

字数: 2.3k 字

更新: 2025-09-24

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云平台 使用说明 SeekSpace 单细胞空间转录组

“基础分析”是分析流程的初始模块，可进行基因、线粒体过滤、去批次整合聚类，保留质量合格的细胞用于后续分析。分析流程创建及过滤整合聚类流程如下：

初始阶段

1. 【新建流程】创建单细胞分析流程。项目开始一般选择样本进行大群分析，后续可选择注释好的细胞类型进行亚群分析。

2. 填写“流程名称”及“流程描述”，用于后续查找和了解流程信息。

3. 【选择数据】选择待分析的样本，可选择已经整合好的多样本数据，也可选多个单样本进行过滤整合。

NOTE

数据详细来源可查看《我的数据》。

4. 【分组】对样本添加分组信息（选填），后续模块也可添加分组信息，详情可见“画图工具”添加标签功能和“差异富集”分组功能。

5. 填写信息，选择待分析的数据，可以选择【开始分析】手动进行过滤整合和聚类，也可以选择【基础分析】、【基础分析+细胞注释】、【基础分析+细胞注释+差异富集】或【基础分析+细胞注释+差异富集+画图工具】快速进行自动分析。

过滤

1. 【开始分析】后的“图表数据”会统计样本UMI、线粒体占比及基因表达情况，简要展示各样本质量信息。

NOTE

指标释义（scRNA-seq）：

• nCount_RNA：每细胞 UMI 总数，反映测序深度与转录本丰度
• nFeature_RNA：每细胞检出的基因数，反映表达复杂度
• 线粒体比例（mito）：线粒体基因 UMI 占比，偏高常与凋亡/损伤相关（高代谢组织可适度放宽）

2. 展开按钮可查看默认参数，用户可参考已发表单细胞文章方法中的过滤参数进行【过滤】。

TIP

如果选择的是已经整合的数据，点击【过滤】会提示是否需要跳过过滤整合步骤。如果不需要调整参数可跳过进行后续分析，如需调整过滤阈值则取消跳过，重新进行过滤整合。

IMPORTANT

过滤策略建议：

• 使用 MAD 动态阈值过滤 mt% 或以 10%-20% 作为参考上限；
• nCount_RNA/nFeature_RNA 以分位数或箱线图上界识别极端异常；
• 多样本时可按样本细胞数做均衡抽样，避免样本量主导聚类；
• 高代谢组织（心/肾/肝等）与免疫/粒细胞丰富样本需适当放宽阈值，避免误删真实细胞。

3. 【过滤】后可查看各样本过滤后质量信息，同时可对单样本进行个性化调整，保证整体样本质量一致。

   

   CAUTION

   避免机械性依赖“拉高细胞数”的操作（如仅凭经验值强行放宽下限）。若瀑布图拐点不清、背景高或低 UMI 群占比异常，强行回收会降低下游稳定性。 双胞（doublet）排查思路：

   • 识别 nCount_RNA/nFeature_RNA 上尾细胞（分布右侧极端高值）；
   • 是否存在互斥 marker 共表达、UMAP 两团之间的“桥状”细胞；
   • 肿瘤项目可结合 CNV 辅助判定；
   • 谨慎过滤：建议多证据一致时再剔除，并在剔除后重做整合与聚类验证一致性。

整合

1. 质控合格的数据进行【整合】，目前提供四种整合方法，其中CCA、Harmony和RPCA会对多个样本进行批次矫正。

   

2. 【整合】后会展示样本整合情况，可调整整合参数重新整合。建议用户尝试多种整合方法，选择更合适的方法进行后续分析。

   

   TIP

   整合方法选择：

   • 批次效应较弱：merge 直接合并，避免过度校正；
   • 中等批次：CCA/RPCA；
   • 批次显著或异构明显：Harmony 更稳健。

   TIP

   效果评估三准则：

   • 批次混合度：同一细胞类型在 UMAP/TSNE 中跨样本均匀混合；
   • 生物信号保留：经典 marker 梯度与分群边界清晰，差异/富集结果符合预期；
   • 过度/欠校正告警：过度校正会抹平差异，欠校正会出现“按批次聚类”。

聚类

【整合】确认后进行【聚类】，可新建选择多个分辨率进行聚类，分辨率越大分群数量越多。后续模块也可新增分辨率进行聚类。

TIP

聚类调参与排错：

• 拐点法：以 PCA 肘部拐点作为 dims 起点，细胞量越大适当增加；
• 子集重聚类：如 T 细胞等大类单独重聚类，放大类内异质性。 dims 过低会遗漏关键异质性，过高易过聚类与放大噪音。请结合拐点与重现性优选。

分析完成

【聚类】后无需调整则点击【完成】，跳转“细胞注释”模块，正式开始进行单细胞相关分析。该步会耗费一定时间，请用户耐心等待。

空间转录组基础分析补充

细胞质控

• 细胞层面过滤（表达矩阵）

  • 推荐使用 UMI 总数、检测到的基因数、线粒体比例三类指标联合筛选；根据样本组织类型自适应阈值。
  • 在 SeekSpace 流程中，常用 --forceCell 与 --min_umi 进行初筛（例如默认提取前80,000个UMI并过滤UMI<200的条形码）。如组织复杂或背景高噪时，适当提高 --min_umi。

• 空间特异的条形码清洗（关键）

  • 过滤“无效的spatial barcode”（表达文库短片段误入、测序错误等导致在HDMI库无位置信息的条形码）。
  • 处理“重复且位置不一致”的spatial barcode：无法唯一定位者剔除。
  • 清除“异常高支持”的空间条形码簇：将芯片按网格（如30×30像素bin）统计，识别并移除疑似脱片/飞溅造成的异常热点（优先剔除该bin中UMI最高的cell barcode对应的spatial barcode）。
  • 最终仅保留通过细胞判定的cell barcode及其对应的有效spatial barcode。

• 唯一中心性检查（多中心细胞过滤）

  • 基于细胞在空间上的UMI分布，定义“中心bin”与“核心区域”，计算核心与次中心的UMI比值（≥2判定为唯一中心）。
  • 剔除多中心细胞，降低条形码混溢或核碎片导致的定位歧义。

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空间映射

• 三库协同（以SeekSpace为例）

  • 表达文库：用于纠错细胞条形码、提取UMI、生成表达矩阵。
  • 空间文库：Spatai 文库 R2带有空间位置 32bp barcode ：在R2上提取spatial barcode，并生成细胞标签(cell barcode)与空间标签(spatial barcode)的对应关系。空间文库的UMI(spatial UMI)代表了每个细胞标签上每个空间标签的表达量。
  • HDMI文库：包含32bp空间条形码及其绝对坐标；获得的reads 前面是32bp 的空间barcode，后面是对应的空间坐标信息。

• 校正与配准流程

  • 条形码层面：
    • 细胞条形码/UMI纠错（允许/禁止错配可配置，如 --skip_misB 等）。
    • 空间条形码白名单化与纠错，绑定至HDMI坐标。
  • 图像层面：
    • 组织图像（DAPI/HE）进行缩放与模糊预处理，分割组织区域。
    • 若自动配准不理想，可人工对齐并保存参数（如 parameters.json），再以“realign”流程复用，生成一致的背景掩膜与对齐图。

• 空间坐标确立与细胞位置判定

  • 依据每个cell barcode 关联的空间条形码的坐标密度，统计在网格bin上的UMI分布；以最大密度bin为细胞中心，并结合核心-次中心比值校验唯一性。
  • 输出 cell_location.tsv.gz 记录细胞在芯片坐标系中的位置，实现表达矩阵的空间锚定与可视化叠加。

以上详细内容可以查看SeekSpace Tools