CytoTRACE拟时序分析文档
前言
TIP
CytoTRACE (Cellular Trajectory Reconstruction Analysis using gene Counts and Expression) 是一种强大的、无需先验知识的拟时序分析工具。它通过评估单个细胞的转录多样性，能够稳健地预测细胞的分化状态，尤其擅长识别发育轨迹的起点（即分化潜能最高的细胞）。
在复杂的生物学系统中，如何确定哪个细胞群是最原始的“根”状态，是拟时序分析中的核心挑战。CytoTRACE基于一个核心假设：分化潜能越高的细胞（如干细胞、祖细胞），其转录活动越复杂，即可检测到的表达基因数量越多。 这一特性使其成为Monocle等轨迹构建工具的理想搭档，能够为轨迹的起点选择提供客观、无偏的证据。
CytoTRACE的核心功能
- 无偏的起点识别：无需指定任何起点或终点，自动预测细胞的分化潜能。
- 稳健性与普适性：在多种组织、物种和测序平台上得到广泛验证。
- 易于解读：提供一个从0（分化终点）到1（分化起点）的连续分数，直观反映细胞的分化程度。
本篇文档旨在为研究者提供一份详尽的CytoTRACE技术指南，内容涵盖其核心原理、在SeekSoulOnline云平台上的操作方法、结果解读、实战案例及常见问题，帮助您将其有效地整合到您的单细胞分析流程中。
CytoTRACE理论基础
核心原理
CytoTRACE的计算过程主要分为三个步骤：
基因计数 (Gene Counts)：计算每个单细胞中表达量大于零的基因总数。这是衡量细胞转录复杂性的一个直接指标。
基因计数特征 (Gene Counts Signature, GCS)：识别那些表达模式与基因计数正相关的基因。首先将表达矩阵标准化，然后计算每个基因与基因计数的相关性，最后选取相关性最强的前200个基因计算其几何平均表达值，得到GCS。
CytoTRACE分数计算：利用细胞间的局部相似性，通过两步平滑处理（马尔可夫模型及非负最小二乘回归）来迭代优化GCS，最终得到每个细胞的CytoTRACE分数。分数经过排序和缩放，范围在0到1之间，其中1代表分化程度最低（干性最高），0代表分化程度最高。
云平台操作指南
在seeksoulonline云平台上进行CytoTRACE分析时，您需要设置以下参数：
参数详解
| 界面参数 | 说明 |
|---|---|
| 任务名称 | 本次分析的任务名称，用于区分不同的分析任务。 |
| 分组因子 | 选择用于定义细胞群体的元数据列，通常是细胞类型注释或聚类结果。 |
| 细胞类型 | 选择要纳入分析的具体细胞亚群。 |
| 筛选因子 | 选择用于筛选样本或分组的元数据列，例如样本来源。 |
| 筛选对象 | 选择要保留用于分析的样本或分组。 |
| Downsample | 是否对细胞进行随机抽样以加速计算，适用于细胞数量庞大的数据集。 |
| Downsample_num | 如果选择抽样，这里设置抽样的细胞数量。 |
| 备注 | 对本次分析的自定义备注信息。 |
结果解读
分析完成后，平台会生成一份详细的报告，包含以下几个核心部分：
5.1 CytoTRACE分数映射图
这是最直观的结果，将CytoTRACE分数映射到UMAP/t-SNE等降维图上。
- 图表解读：每个点是一个细胞，颜色代表CytoTRACE分数。通常黄色代表高分（分化潜能高，接近起点），紫色代表低分（分化程度高，接近终点）。
- 分析要点：观察哪个细胞群颜色最亮（得分最高），这个细胞群就是轨迹的生物学起点。
5.2 分数箱线图
- 图表解读：按细胞类型（或您选择的分组）展示CytoTRACE分数的分布。
- 分析要点：定量比较不同细胞群体的分化潜能。例如，干细胞群的箱体位置应显著高于其他已分化细胞群。
5.3 CytoTRACE相关基因条形图
- 图表解读：该图通过条形图（Bar Plot）展示了与CytoTRACE分数相关性最强的基因。横轴代表相关性系数，纵轴是基因名称。
- 分析要点：
- 正相关基因（红色/暖色）：条形朝右，表示这些基因的表达量与高分化潜能正相关。它们通常是与干性维持、祖细胞特性或细胞周期相关的基因。
- 负相关基因（蓝色/冷色）：条形朝左，表示这些基因的表达量与低分化潜能（即高度分化）正相关。它们通常是细胞终末分化的功能性基因或标记基因。
- 通过分析这些基因，可以深入理解调控细胞分化状态的核心分子网络。
5.4 结果文件列表
核心数据文件：CytoTRACE_result.csv
这是分析最关键的输出文件，包含了每个细胞的详细评分信息：
| 列名 | 详细说明 |
|---|---|
| CytoTRACE | 预测的细胞分化潜能得分，范围从 1.0 (分化程度最低) 到 0.0 (分化程度最高)。 |
| CytoTRACErank | 根据 CytoTRACE 分数进行的排名。排名越高，代表细胞分化程度越低。 |
| GCS | 基因计数特征 (Gene Counts Signature)，是与基因计数正相关的前200个基因的几何平均值。 |
| Counts | 每个细胞中检测到的表达基因总数 (Gene Counts)。 |
主要图表与文件
| 文件名 | 内容说明 |
|---|---|
CytoTRACE_result.csv | 上述核心数据文件。 |
CytoTRACE_plot_table.txt | 用于绘制分数箱线图的绘图数据。 |
CytoTRACE_plot.png/pdf | CytoTRACE分数在降维图上的映射图。 |
CytoTRACE_by_Phenotype_Boxplot.png/pdf | 按细胞类型展示的分数箱线图。 |
CytoGenes.png/pdf | 与CytoTRACE分数正负相关的Top基因条形图。 |
应用案例
文献来源: A pan-cancer single-cell transcriptional atlas of tumor infiltrating myeloid cells. Cell. 2021
研究背景: 该研究希望探究肿瘤浸润树突状细胞（DC）中一个成熟的LAMP3+ DC亚群的发育起源。
分析方法: 研究人员利用CytoTRACE评估了不同DC亚群的分化状态。结果显示，经典的cDC1和cDC2亚群相比于成熟的LAMP3+ DC亚群具有更高的CytoTRACE分数，表明它们处于更早的分化阶段。这一结果为LAMP3+ cDCs可能由cDC1和cDC2分化而来的假设提供了有力证据。
注意事项
1. CytoTRACE不是轨迹构建工具：它本身不生成细胞的连接路径或分支，而是为每个细胞提供一个“分化潜能”的度量。它的最佳用途是与其他工具（如Monocle2/3）结合，为其提供客观的起点信息。
2. 警惕技术性偏差：CytoTRACE的核心是基因计数，因此结果对测序深度和批次效应敏感。如果不同细胞类型在不同批次测序，或测序深度差异巨大，可能会引入技术偏差。在解释结果时需考虑这些因素。
3. 先分群，再分析：如果您的数据集包含生物学上完全不相关的细胞谱系（如免疫细胞和上皮细胞），建议先将它们分离，然后对您感兴趣的谱系（如T细胞分化谱系）单独运行CytoTRACE，结果会更有意义。
常见问题解答(FAQ)
Q1: 为什么应该使用 CytoTRACE？
A: CytoTRACE 可以在没有任何先验知识的情况下预测细胞分化状态，特别适用于以下场景：
- 在发育层次尚不明确的人类组织中预测分化状态。
- 在癌症等病变组织中研究细胞分化异质性。
- 为Monocle等轨迹构建工具提供客观、无偏的起点建议。
- 鉴定与干细胞特性和分化过程相关的关键基因。
Q2: 在哪些情况下 CytoTRACE 可能不适用或需要额外注意？
A: 在以下几种情况，建议进行额外的预处理或结果解读时需特别注意：
- 包含多种异质组织的数据集: CytoTRACE 会对数据集中所有细胞进行排序。如果数据来自完全不同的组织系统（如造血细胞和内皮细胞混合），建议先将其拆分再分别运行CytoTRACE。
- 包含静息和增殖干细胞群的数据: CytoTRACE本身可能难以区分这两种状态。可以结合总RNA含量等指标进行区分，通常静息干细胞的RNA含量较低。
- 强烈的批次效应: 如果不同细胞类型在不同批次中测序，可能会引入技术差异导致的基因计数偏差，从而影响结果。实验设计时应尽量避免此类批次效应。
参考文献
- Gulati, G. S., et al. (2020). Single-cell transcriptional diversity is a hallmark of developmental potential. Science, 367(6476), 405–411.
- Cheng S, et al. (2021). A pan-cancer single-cell transcriptional atlas of tumor infiltrating myeloid cells. Cell, 184(3):792-809.e23.