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SCENIC分析技术培训文档 ​

作者: SeekGene
时长: 13 分钟
字数: 3.5k 字
更新: 2025-09-11
阅读: 0 次

前言 ​

IMPORTANT

SCENIC（Single-Cell rEgulatory Network Inference and Clustering）是单细胞转录组学中用于推断基因调控网络和细胞状态的重要工具。它能够帮助研究者理解细胞异质性背后的转录调控机制，识别细胞类型特异性的调控因子。

在单细胞研究中，我们不仅关注细胞的分类和标记基因，更希望深入了解驱动细胞状态转变的转录调控网络。SCENIC通过整合转录因子与靶基因的共表达关系以及DNA motif分析，构建细胞特异性的调控网络，为解析细胞功能和发育提供重要线索。

SCENIC的核心功能 ​

  • 基因调控网络推断：基于基因共表达模式推断转录因子与靶基因的调控关系
  • 调控活性评估：通过AUCell算法计算每个细胞中调控子（Regulon）的活性状态
  • 细胞状态识别：基于调控网络活性对细胞进行分组和注释
  • 调控子特异性分析：识别在特定细胞类型中特异性活跃的调控因子

本篇文档旨在为单细胞研究者提供一份详尽的SCENIC技术指南，内容涵盖其基本原理、在SeekSoulOnline云平台上的操作方法、结果解读、实战案例及常见问题，帮助您快速掌握并应用该工具。

SCENIC理论基础 ​

核心原理 ​

SCENIC的核心思想是：通过识别转录因子与其靶基因的共表达模块，并结合DNA motif分析验证调控关系，构建细胞特异性的基因调控网络。这一过程可以概括为三个主要步骤：

  1. 基因调控网络推断 (GRN inference)：使用GENIE3或GRNBoost算法基于基因表达相关性推断转录因子(TF)与潜在靶基因之间的调控关系
  2. 调控子修剪与富集分析 (Regulon pruning and enrichment)：利用RcisTarget对推断的调控关系进行motif富集分析，去除假阳性调控关系，形成可靠的调控子(Regulon)
  3. 调控子活性评估 (Regulon activity scoring)：使用AUCell算法计算每个细胞中每个调控子的活性状态(AUC值)

关键算法详解 ​

1. GENIE3/GRNBoost - 基因调控网络推断 ​

  • 原理：基于随机森林或梯度提升算法，计算每个转录因子与其潜在靶基因表达模式的相关性
  • 输出：TF-target调控关系及重要性得分(importance)，得分越高表示调控关系越可靠

2. RcisTarget - motif富集分析 ​

  • 原理：基于已知的转录因子结合位点数据库，对推断的调控关系进行motif富集分析
  • 作用：验证调控关系的可靠性，去除间接调控和假阳性结果
  • 输出：经过修剪的调控子(Regulon)，包含TF、靶基因及其motif信息

3. AUCell - 调控子活性评估 ​

  • 原理：基于基因集富集分析(GSEA)思想，计算每个细胞中调控子靶基因集合的富集程度
  • 输出：每个细胞中每个调控子的活性得分(AUC值)，用于后续分析

调控子特异性分析指标 ​

1. RSS (Regulon Specificity Score) ​

  • 定义：调控子在特定细胞类型中的特异性得分
  • 计算：基于AUC值在不同细胞类型间的分布差异
  • 应用：识别细胞类型特异性的关键调控因子

2. Z-score ​

  • 定义：调控子在特定细胞类型中的标准化活性得分
  • 计算：基于调控子在目标细胞类型与其它细胞类型间AUC值的差异
  • 应用：量化调控子在不同细胞类型中的相对活性

云平台操作指南 ​

在云平台上，SCENIC分析流程被设计得直观易用。您无需编写代码，只需通过参数配置界面即可完成分析。

分析前的准备 ​

IMPORTANT

SCENIC分析的成功与否，很大程度上取决于输入数据的质量和生物学问题的合理性。在开始分析前，请务必确认：

  1. 数据已完成预处理：您的单细胞数据已经过标准的质控、降维、聚类和细胞类型注释。
  2. 选择了合适的细胞亚群：SCENIC分析应在具有生物学意义的细胞亚群中进行，如已注释的细胞类型或功能相关的细胞簇。
  3. 确保数据规模适中：对于超过数万个细胞的数据集，建议开启Downsample进行分析以避免内存不足。

参数详解 ​

下表详细列出了云平台SCENIC分析模块的主要参数及其说明。

界面参数说明
任务名称本次分析的任务名称，需以英文字母开头。
物种选择该分析流程数据对应的物种名称，目前支持人、小鼠和果蝇。
分组因子选择要分析的细胞类型或聚类对应的标签，例如celltype。
细胞类型多选，选择要纳入分析的具体细胞类型或聚类。
拆分因子多选，绘图时用于拆分不同组别的标签，如Group或Sample。
Downsample是否对大数据集进行随机下采样。
Downsample_num每个细胞亚群下采样保留的细胞数目。
基于历史结果分析选择"Regulon画图"，可基于已完成的分析任务重新绘图。
历史任务名称选择一个已成功的SCENIC任务。
Regulon在历史任务结果中，选择要重新绘图的Regulon名称。
备注自定义备注信息。

重要注意事项 ​

CAUTION

  • 大数据集处理：当细胞总数超过数万时，若Downsample参数设置为False，分析可能会因内存不足而失败。强烈建议开启Downsample进行分析。
  • Metadata规范：请确保RDS文件中的metadata列名和内容不包含中文或特殊字符（如&），否则可能导致流程错误。
  • 物种匹配：确保选择的物种与实际数据匹配，否则会影响motif数据库的准确性。

操作流程 ​

  1. 进入分析模块：在云平台导航至"高级分析"模块，选择"scenic"。
  2. 创建新任务：为您的分析任务命名，并选择要分析的样本或项目。
  3. 配置参数：根据上述指南，选择要分析的细胞类型、分组信息等。
  4. 提交任务：确认参数无误后，点击"提交"按钮，等待分析完成。
  5. 下载与查看：分析结束后，在任务列表中下载并查看生成的分析报告和结果文件。

结果解读 ​

SCENIC的分析报告包含丰富的图表和数据文件，以下是对核心结果的详细解读。

1. 结果文件列表 ​

文件名内容说明
adj_grn_filter.csv共表达模块基于motif分析筛选之后的表格，可查看TFs及其靶基因相关性。
reg_cxt.csvTFs-motif分析结果，根据motifID可搜索motif logo图片。
auc_mtx.csvRegulon在各细胞中AUC打分矩阵文件。
auc_thresholds.csv判定Regulon在细胞中是否开放的阈值。
binary_mtx.csvauc_mtx.csv文件基于auc_thresholds转换的二进制文件。
celltype_rss.csv进行分析的细胞群各Regulon特异性得分结果。
celltype_rss_top5reg.csv进行分析的细胞群筛选特异性得分top5 Regulon。
celltype_z.csv进行分析的细胞群各Regulon Z值结果。

2. 调控子活性可视化 ​

AUC热图 ​

AUC热图

  • 图表解读：展示各细胞中调控子活性(AUC)的热图。
  • 颜色含义：红色表示高活性，蓝色表示低活性。

二值化热图 ​

二值化热图

  • 图表解读：基于AUC阈值转换的二值化热图。
  • 颜色含义：黑色表示调控子处于活跃状态，白色表示调控子处于非活跃状态。
降维图 ​

降维图

  • 图表解读：在UMAP/tSNE图上展示调控子活性的空间分布。
  • 左右图对比：
    • 左图：调控子靶基因的表达水平
    • 右图：调控子活性(AUC)的空间分布

应用案例 ​

案例一：肿瘤微环境中关键转录因子的识别 ​

  • 文献：Aibar S, González-Blas CB, Moerman T, et al. Nat Methods. 2017.
  • 背景：目标是识别在肿瘤浸润免疫细胞中具有特异性调控活性的转录因子（Regulon），以寻找潜在的治疗靶点或生物标志物。
  • 分析策略：在注释好的免疫细胞群（如CD8+ T细胞、巨噬细胞）中运行SCENIC完整流程（GENIE3/GRNBoost → RcisTarget → AUCell），计算每个Regulon在细胞中的AUC并基于RSS得分筛选细胞类型特异性Regulons；将结果与差异表达基因和临床表型（如免疫检查点表达）进行联合分析。
  • 核心发现：
    1. 在肿瘤相关巨噬细胞中识别出若干具有高RSS的调控子（例如STAT3相关Regulon），其AUC在肿瘤样本中显著上调。
    2. 这些Regulon的靶基因富集于“炎症反应”“免疫抑制”路径，与临床样本的免疫抑制表型一致。
    3. 部分高RSS的转录因子经过文献回顾也被报道与肿瘤免疫微环境调控相关，支持结果的可靠性。

案例二：发育或分化过程中调控网络的动态重构 ​

  • 文献：Van de Sande B, Flerin C, Davie K, et al. Nat Protoc. 2020.
  • 背景：研究细胞命运决策期间转录调控网络如何随时间发生重构，识别负/正调控主导因子。
  • 分析策略：对不同发育阶段或分化时间点的单细胞数据分别运行SCENIC，比较不同时间点的Regulon AUC矩阵与RSS分布，关注随时间显著变化的Regulon并结合motif信息验证直接调控可能性。
  • 核心发现：
    1. 识别到在分化早期活性高的若干Regulon（如某些干细胞维持相关TF），其AUC随分化进程下降；与此同时出现一组分化终末状态相关的Regulon AUC上升。
    2. motif富集分析支持部分Regulon为直接调控关系，提示这些TF可能在命运决定中发挥因果作用。

案例三：药物/处理条件下Regulon响应的鉴定与验证 ​

  • 文献：Huynh-Thu VA, Irrthum A, Wehenkel L, et al. PLoS One. 2010.
  • 背景：评估药物处理对细胞调控网络的影响，筛选出药物诱导或抑制的关键Regulon。
  • 分析策略：合并处理组与对照组数据，运行SCENIC并计算每个细胞的AUC；对组间AUC进行差异分析，筛选显著改变的Regulon并通过富集分析和外部数据（如ChIP-seq）验证其可能直接靶向关系。
  • 核心发现与验证：
    1. 发现某些Regulon在处理组中AUC显著下降，提示药物可能通过抑制特定TF活性发挥作用。
    2. 结合ChIP-seq或公开数据库验证后，确认部分靶基因为该TF的直接靶基因，从而为药物作用机制提供分子证据。

注意事项与最佳实践 ​

TIP

避免过度解读：SCENIC结果是基于转录组数据的计算推断，不等于真实的调控关系。任何关键发现都需要后续的生物学实验（如ChIP-seq、报告基因实验）来证实。

常见问题解答 (FAQ) ​

Q1: SCENIC分析需要多长时间？

A: 分析时间取决于数据规模和计算资源配置。一般来说：

  • 小数据集(1,000-5,000细胞)：1-2小时
  • 中等数据集(5,000-20,000细胞)：2-6小时
  • 大数据集(>20,000细胞)：6-24小时或更长 建议开启Downsample以加快分析速度。

Q2: NES值和AUC值的意义是什么？

A:

  • NES (Normalized Enrichment Score)：标准化富集分数，用于评估motif富集的显著性。NES>3通常被认为是显著富集。
  • AUC (Area Under the Curve)：曲线下面积，用于计算NES，同时也反映了调控子活性水平。

Q3: RSS和Z-score有什么区别？

A:

  • RSS (Regulon Specificity Score)：调控子特异性得分，衡量调控子在特定细胞类型中的特异性。值越高表示调控子在该细胞类型中越特异。
  • Z-score：标准化活性得分，衡量调控子在特定细胞类型中的相对活性。值越高表示调控子在该细胞类型中活性越强。

Q4: 如何验证SCENIC分析结果的可靠性？

A: 可通过以下方式验证结果可靠性：

  1. 生物学验证：结合已知文献和数据库验证关键调控关系
  2. 实验验证：通过ChIP-seq、报告基因实验等方法验证关键调控因子
  3. 交叉验证：使用不同的数据集或分析方法验证结果一致性

参考文献 ​

  1. Aibar S, González-Blas CB, Moerman T, et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nat Methods. 2017 Nov;14(11):1083-1086. doi: 10.1038/nmeth.4463. Epub 2017 Oct 9. PMID: 28991892; PMCID: PMC5937676

  2. Huynh-Thu VA, Irrthum A, Wehenkel L, et al. Inferring regulatory networks from expression data using tree-based methods. PLoS One. 2010 Sep 28;5(9):e12776. doi: 10.1371/journal.pone.0012776. PMID: 20927193; PMCID: PMC2946910

  3. Van de Sande B, Flerin C, Davie K, et al. A scalable SCENIC workflow for single-cell gene regulatory network analysis. Nat Protoc. 2020 Jul;15(7):2247-2276. doi: 10.1038/s41596-020-0336-2. Epub 2020 Jun 19. PMID: 32561888

  4. He Y, Chen Q, Dai J, et al. Single-cell RNA-Seq reveals a highly coordinated transcriptional program in mouse germ cells during primordial follicle formation. Aging Cell. 2021 Jul;20(7):e13424. doi: 10.1111/acel.13424. Epub 2021 Jun 26. PMID: 34174788;PMCID: PMC8282241

  5. Wang JJ, Ge W, Zhai QY, et al. Single-cell transcriptome landscape of ovarian cells during primordial follicle assembly in mice. PLoS Biol. 2020 Dec 22;18(12):e3001025. doi: 10.1371/journal.pbio.3001025. PMID: 33351795; PMCID: PMC7787681

  6. Zhao B, Jiang X. hsa-miR-518-5p/hsa-miR-3135b Regulates the REL/SOD2 Pathway in Ischemic Cerebral Infarction. Front Neurol. 2022 Apr 11;13:852013. doi: 10.3389/fneur.2022.852013. PMID: 35481271; PMCID: PMC9038098

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