云平台差异富集分析使用指南

作者: 高瑞峰

时长: 14 分钟

字数: 3.8k 字

更新: 2025-09-15

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云平台 使用说明 差异分析 富集分析

概述

什么是差异富集分析

差异富集分析旨在识别不同细胞群体或条件下显著差异表达的基因，并评估这些基因在功能/通路中的富集，通常分为两步：

1. 差异表达分析：发现显著变化基因
2. 功能富集分析：解释这些基因的功能与通路背景

NOTE

差异富集分析是单细胞解读的核心环节，务必结合生物学背景合理设置分组与阈值。

生物学意义

差异富集分析在单细胞研究中具有重要价值：

• 细胞功能鉴定：通过差异基因识别细胞类型特异性标记基因，帮助理解不同细胞群体的功能特征
• 生物学过程探索：通过功能富集分析揭示细胞在不同状态下的生物学过程变化
• 疾病机制研究：比较健康与疾病状态下的基因表达差异，发现潜在的疾病相关通路
• 药物靶点发现：识别药物处理前后差异表达的基因和通路，为药物开发提供线索

分析价值

通过差异富集分析，研究人员可以获得：

• 细胞类型标记基因列表，用于细胞注释和功能鉴定
• 活跃的生物学通路信息，揭示细胞功能状态
• 潜在的调控机制，为后续实验提供方向
• 生物学假设，指导深入的功能验证研究

使用说明

新建比较方案开始分析

点击页面右上角【新建方案】按钮，弹出比较方案窗口，再点击【新建方案】按钮，弹出新增比较方案窗口。新增比较方案主要包括三部分内容："方案名称"、"细胞分组"和"比较组合"。

1. "方案名称"应填写一个能够清晰反映比较情况、便于区分和查找的名称。
2. "细胞分组"选择要分析的对象，可以选择聚类或细胞注释标签，也可以选择样本或样本分组标签，必选。如果没有合适的分组标签，可点击【分组】按钮新建分组标签，建好后即可在细胞分组下拉框中选择新建分组标签。
3. "比较组合"选择要进行比较的对象，可以选择聚类或细胞注释标签，也可以选择样本或样本分组标签，非必选。如果比较组合数量超过5组，需要点击【展开】显示全部组合，最多可选择10组比较组合。"vs"前为实验组（比较组），后为对照组（被比较组），点击"vs"可调整比较组合顺序。

创建好比较方案，选择好差异分析和富集分析参数后，点击【保存】即可进行差异富集分析。

比较方案的含义

1. "细胞分组"选择聚类或细胞注释标签，"比较组合"选择样本或样本分组标签，是2个样本之间同一种细胞类型进行比较。

   

2. "细胞分组"选择样本或样本分组标签，"比较组合"选择聚类或细胞注释标签，是同一个样本的2种细胞类型进行比较。

   

3. 只选择"细胞分组"不选择"比较组合"，即可实现每一个细胞分组与其他细胞分组的比较，即1 vs 多。

   

比较方案的修改与删除

比较方案中记录着所有比较方案的详细信息，可点击【编辑】按钮对已有方案进行修改，或点击【删除】按钮对方案进行删除。操作完成后可点击背景或右上方的【关闭】按钮返回主界面。

差异表达分析

分析方法

参考：presto 官方文档，Seurat FindMarkers

软件	检验方法	核心原理	优点	缺点	适用场景与推荐
Presto	wilcox	非参数 Wilcoxon 秩和检验（高效实现，含 auROC 统计）	- 面向大样本高效 - 内存友好	- 极端稀疏/强不平衡需配合降采样	≥1,000 细胞/组的大样本；与 downSample、maxCell 搭配
FindMarkers	wilcox	非参数检验，比较两组分布中位数与秩次差异	- 分布假设弱、稳健	- 对极端不平衡/方差差异敏感	默认首选，通用稳健
FindMarkers	bimod	对数正态的似然比检验	- 贴合 log-normal 表达	- 对分布假设敏感	表达近似连续且接近对数正态
FindMarkers	roc	ROC/auROC 基于可分性评估标志基因	- 直观评估可分性	- 不返回p值；解释偏向可分性	标志物筛选、辅助评估
FindMarkers	t	学生 t 检验，比较两组均值	- 简单快速	- 需正态性与方差齐性；对离群点敏感	近似正态、样本量适中
FindMarkers	negbinom	负二项分布检验（计数、过度离散）	- 适配 UMI 计数/过度离散	- 计算较慢、参数估计复杂	原始计数、离散度较高
FindMarkers	poisson	泊松分布检验（稀疏计数）	- 简单刻画稀疏计数	- 忽略过度离散	稀疏、近似泊松场景
FindMarkers	LR	似然比检验（嵌套模型比较）	- 可纳入协变量	- 模型设定要求高	需要模型化与协变量时
FindMarkers	MAST	GLM 模型，考虑零膨胀特性	- 适配零膨胀单细胞表达	- 计算复杂、耗时	存在大量零表达、需严谨建模

参数说明

• 基因最低表达比例：设置基因在细胞中表达的最小比例阈值（默认0.1，即10%），表达该基因的细胞比例在任何一组中低于该阈值时，则该基因将不会列入差异基因列表。可以通过过滤低表达的基因加快分析速度。
• 基因最低差异倍数：设置上下调差异倍数的最小绝对值(average Log2 fold change)。默认为0.25，表示仅保留cluster间表达差异倍数log2FC ≥ 0.25和log2FC ≤ -0.25的基因。可根据差异基因数量适当调整该阈值，增加基因最低差异倍数会加快分析速度，但可能会丢失部分基因。该值范围为大于0。
• 显著性阈值方式（p 值/校正 p 值）：设定判定基因表达差异是否显著的筛选阈值，默认p_val_adj < 0.05。若差异基因过多，可适当调低阈值，如0.01；若不以该条件筛选，请填写1。p_val_adj范围为[0,1]。
• DownSample：是否进行细胞抽样，默认是。通过降低细胞数量加快分析速度。
• 每个聚类最大细胞数：设置每个细胞群中最大细胞数。针对细胞抽样情况（即downSample等于是），细胞总数高于该阈值的细胞群，随机选择该阈值个细胞进行差异分析，细胞总数低于该阈值的细胞群，则使用所有的细胞进行差异分析。

功能富集分析

分析方法

参考：clusterProfiler 官方文档

方法	函数	核心	输入	输出/可视化	适用场景
ORA（过度表示分析）	clusterProfiler::enricher	超几何/Fisher：评估差异基因中的过度表示	差异基因列表 + TERM2GENE（GO/KEGG/Reactome/MSigDB）	富集表；DotPlot、BarPlot	已有差异基因集合，聚焦显著条目
GSEA（基因集富集分析）	clusterProfiler::GSEA	ES/NES + 置换评估整体协调变化	全量有序基因（如按 avg_log2FC）+ TERM2GENE	NES、p.adjust；ES 曲线；Dot/Bar	信号弱或整体变化，避免硬阈值

数据库与数据集

• 系统支持包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、果蝇、线虫、猫、狗、牛、鸡、马、猕猴、猪、鸭嘴兽、负鼠、绿安乐蜥、爪蟾、酵母、黑猩猩等上百个物种的数据库。可以参考我的数据库查看感兴趣的物种。
• 数据库与数据集需根据物种和研究目的灵活选择，如功能注释优先GeneOntology，通路分析可选KEGG或Reactome。

数据库	可选数据集
GeneOntology	Molecular Function（分子功能）、Biological Process（生物过程）、Cellular Components（细胞组分）
Pathway	KEGG
MSigDB	H（Hallmark）、C1（定位基因集）、C2（已知功能集）、C3（调控靶点集）、C4（计算预测集）、C5（本体集）、C6（致癌特征集）、C7（免疫特征集）、C8（细胞类型集）、H_C2_C5（H、C2、C5 联合库）
Reactome	Reactome 通路库

参数说明

• pvalueCutoff：判定富集显著性的p值阈值，通常需满足p < 0.05。
• qvalueCutoff：校正后p值（FDR）的显著性阈值，通常需满足p < 0.05（大规模数据可降低qvalueCutoff至0.01））。
• minGSSize：最小基因集大小（过滤过小基因集，降低假阳性），默认 10。
• maxGSSize：最大基因集大小（过滤过大基因集，避免广谱功能干扰），默认 500。

结果解读

差异表达分析结果

顶部：通过左上角“分组/比较”与方案下拉框联动控制；柱状图中点击高亮单元可快速定位到右侧对应结果。

火山图

火山图是差异表达分析结果的重要可视化工具：

• X轴：对数倍数变化（log2FC）
• Y轴：-log10(p值)
• 颜色：
  • 红色：显著上调基因
  • 蓝色：显著下调基因
  • 灰色：无显著差异基因
• 阈值线：垂直虚线表示倍数变化阈值，水平虚线表示显著性阈值

热图

热图显示差异基因在不同细胞群体中的表达模式：

• 行：差异表达基因
• 列：细胞群体
• 颜色：基因表达水平（红色表示高表达，蓝色表示低表达）
• 聚类：基因和细胞群体的聚类结果

小提琴图

小提琴图显示基因表达在不同细胞群体中的分布：

• X轴：细胞群体
• Y轴：基因表达水平
• 形状：表达分布的密度曲线
• 箱线图：中位数、四分位数等统计信息

底部：整体火山图与整体气泡图（随“分组/比较”视角切换做聚合展示）。

视角	图片
分组
比较

富集分析结果

中部：

• 左侧表格：差异分析和富集分析结果表格，支持搜索、筛选、排序；点击【分析参数】可修改检验方法/阈值并重算。点击下载可下载差异分析或富集分析的表格。
• 右侧图区：富集 DotPlot、BarPlot、ES 图（按所选数据库与通路关注集展示）。

气泡图

气泡图是富集分析结果的主要可视化形式：

• X轴：基因比例（GeneRatio）
• Y轴：富集通路名称
• 气泡大小：富集基因数量
• 颜色：显著性水平（p值或q值）

条形图

条形图显示富集通路的排名和显著性：

• X轴：富集评分或基因数量
• Y轴：富集通路名称
• 颜色：显著性水平
• 排序：按富集程度或显著性排序

GSEA 富集评分图

GSEA结果包含富集评分图：

• X轴：基因排序位置
• Y轴：富集评分
• 曲线：富集评分曲线
• 垂直线：富集基因的位置
• 热图：基因表达水平

TIP

差异富集结果可结合画图工具进一步可视化，便于结果解读和汇报。

总结

云平台差异富集分析工具提供了完整的分析流程，从差异表达分析到功能富集分析，帮助研究者深入理解单细胞数据的生物学意义。通过合理设置参数和正确解读结果，可以获得高质量的生物学发现。

常见问题解答

Q1：差异分析方法怎么选？

• 默认使用 Wilcoxon（FindMarkers: wilcox），分布假设弱、通用稳健。
• 样本量大（≥1,000/组）或性能要求高：优先 Presto（高效 Wilcoxon/auROC）。
• 计数数据过度离散：考虑 negbinom。
• 零表达多、需建模：考虑 MAST。
• 近似正态、样本量适中：可用 t 检验。
• 需纳入协变量：用 LR（似然比）。

Q2：差异基因太多/太少如何调整？

• 太多：增大 logFC 阈值（如 0.25→0.5）、提高 min.pct（0.05→0.1）、收紧 p_val_adj（0.05→0.01）。
• 太少：减小 logFC 阈值、降低 min.pct、放宽 p_val_adj（0.05→0.1 或 1）。
• 大样本偏慢：开启 downSample，并设置 max.cells.per.ident（如 3,000–10,000）。

Q3：p 值还是校正 p 值？

• 推荐优先使用 校正 p 值 p_val_adj ≤ 0.05；多组比较或通路众多时可更严格（≤0.01）。
• 若仅做探索且希望不过滤，可临时将阈值设为 1。

Q4：ORA 和 GSEA 什么时候用？

• 已有明确的差异基因集合、聚焦显著条目：用 ORA（enricher）。
• 整体信号弱或担心阈值筛选丢信息：用 GSEA（按全基因排序）。
• 数据库选择：功能注释优先 GO（BP/MF/CC）；通路分析常用 KEGG/Reactome；也可选 MSigDB 子集。

Q5：运行很慢怎么办？

• 选择 Presto；启用 downSample 并设置 max.cells.per.ident；
• 缩小数据库/通路集合范围；
• 检查方案是否包含过多比较组合，必要时分批执行。

Q6：结果与预期不一致怎么排查？

• 核对“分组/比较”是否选对标签与方向（vs 左侧为实验组）。
• 查看是否开启抽样导致波动；调整阈值后重算对比。
• 关注批次/个体差异，必要时改用更稳健方法或提高阈值。

Q7：富集数据库没找到对应物种？

• 平台内置上百个个常见物种库；如未覆盖，请确认物种设置是否正确，或自行上传新建数据库，详细操作参考我的数据库。

TIP

建议结合生物学背景合理设置参数，并在页面中使用“分析参数”进行重算与对比；解读页面提供的图表与结果。

参考文献

• Presto 官方文档
• Seurat FindMarkers / FindAllMarkers
• clusterProfiler 官方文档