CopyKAT拷贝数变异分析文档
前言
TIP
CopyKAT (Copynumber Karyotyping of Tumors) 是一款创新的单细胞CNV分析工具，其最大特点是能够自动、无监督地从单细胞转录组数据中区分肿瘤细胞（非整倍体）和正常细胞（二倍体），并进一步解析肿瘤内部的亚克隆结构。
与需要手动指定正常参考细胞的工具不同，CopyKAT通过集成的贝叶斯方法，自动在输入的细胞群体中识别出一组基因组最稳定的细胞作为内参。这一特性使其在以下场景中尤为强大：
- 缺乏明确的正常对照：当样本中没有可以确信为“正常”的细胞类型时。
- 探索未知肿瘤成分：在复杂的肿瘤微环境中，自动识别潜在的恶性细胞群。
- 简化分析流程：无需预先注释细胞类型，即可进行初步的肿瘤/正常细胞划分。
本篇文档将详细介绍CopyKAT的理论基础、云平台操作方法、结果解读及相关应用案例。
CopyKAT理论基础
核心原理
CopyKAT的核心假设是：在大多数肿瘤组织中，存在着基因组稳定的二倍体细胞（如免疫细胞、基质细胞）和基因组不稳定的非整倍体肿瘤细胞。这两类细胞的基因表达谱在全基因组尺度上存在系统性差异。
它通过一个多步骤的算法来识别这种差异：
分析流程概览
- 数据标准化：对输入的基因表达矩阵进行标准化，稳定技术性方差。
- 无监督寻找正常细胞：通过高斯混合模型（Gaussian Mixture Model）分析所有细胞的基因表达分布，自动识别出一组最可能代表二倍体正常细胞的群体作为内参。
- 计算相对表达：以这组内参细胞为基准，计算其他每个细胞的基因相对表达水平。
- CNV片段识别：利用马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）方法，沿着染色体对基因表达信号进行分割，识别出CNV的断点（breakpoints），从而定义出具有一致拷贝数状态的染色体片段。
- 细胞分类：基于每个细胞的CNV谱，利用贝叶斯方法计算其属于“非整倍体”（aneuploid）或“二倍体”（diploid）的后验概率，从而对细胞进行分类。
- 亚克隆分析：在被分类为“非整倍体”的肿瘤细胞内部，通过对它们的CNV模式进行层次聚类，进一步划分出具有不同CNV特征的肿瘤亚克隆。
云平台操作指南
在云平台上，CopyKAT的分析流程非常简洁。
参数详解
| 界面参数 | 说明 |
|---|---|
| 任务名称 | 本次分析的任务名称，需以英文字母开头，可包含英文字母、数字、下划线和中文。 |
| 分组因子 | 选择要分析的细胞类型或聚类对应的标签（如CellAnnotation），与下方的“细胞类型”配合使用。 |
| 细胞类型 | 多选，选择要分析的具体细胞类型或聚类（如Epithelial cell等）。 |
| 物种 | 选择数据对应的物种，目前支持人和小鼠。 |
| 筛选因子 | 选择用于筛选样本或分组的标签（如Sample）。 |
| 筛选对象 | 多选，选择在筛选因子中要保留的样本或分组（如Sample_A）。 |
| Downsample | 是否对细胞进行降采样（抽取部分细胞）进行分析。 |
| Downsample_num | 若启用降采样，此处设置抽取的细胞数量。 |
| 备注 | 自定义备注信息。 |
TIP
CopyKAT非常适合用于对整个细胞群体进行初步的恶性/非恶性筛选。您可以选择所有的细胞类型作为输入，让算法自动完成分类。
操作流程
- 进入分析模块：在云平台导航至“高级分析”模块，选择“copyKAT”。
- 创建新任务：为您的分析任务命名，并选择要分析的样本或项目。
- 配置参数：根据上述指南，选择要分析的细胞类型、分组信息等。
- 提交任务：确认参数无误后，点击“提交”按钮，等待分析完成。
- 下载与查看：分析结束后，在任务列表中下载并查看生成的分析报告和结果文件。
结果解读
CopyKAT的报告直观地展示了细胞分类和CNV的结果。
细胞类型推断热图
这是CopyKAT的核心结果图，展示了所有细胞的CNV谱以及对其“肿瘤/正常”身份的预测。
- 图表解读：
- 行：代表单个细胞。
- 列：代表按染色体位置排序的基因。
- 颜色（热图主体）：红色表示拷贝数增加，蓝色表示拷贝数减少。
- 颜色（行注释）：左侧的颜色条带是CopyKAT对细胞的分类结果。通常，绿色代表预测的“二倍体”（正常）细胞，橙色或其他暖色调代表预测的“非整倍体”（肿瘤）细胞。
- 分析要点：
- 观察是否存在一个明显的细胞群被预测为“非整倍体”，并且该群组显示出清晰的CNV模式（大片红色/蓝色区域）。
- 检查被预测为“二倍体”的细胞群是否CNV信号较弱（颜色接近中性）。
细胞分类结果降维图
为了直观地查看预测结果在细胞空间上的分布，报告会将分类结果投影到UMAP图上。
- 图表解读：图中每个点是一个细胞，颜色代表CopyKAT的预测结果（例如，正常 vs. 肿瘤）。
- 分析要点：检查预测的肿瘤细胞是否与您预先注释的肿瘤细胞聚类重合度高。
肿瘤亚克隆分析
在识别出肿瘤细胞后，CopyKAT会进一步对它们进行亚克隆分析。
- 图表解读：该热图只展示被预测为“非整倍体”的肿瘤细胞。通过对它们的CNV模式进行聚类，可以将肿瘤细胞划分为不同的亚克隆（如热图行注释中的c1, c2等）。
- 分析要点：比较不同亚克隆之间的CNV差异。例如，亚克隆c1可能携带了亚克隆c2没有的特定染色体扩增，这可能代表了肿瘤的演进方向。
- 图表解读：将识别出的肿瘤亚克隆（c1, c2等）投影到UMAP图上，可以观察它们在细胞空间的分布关系。
应用案例
案例一：骨肉瘤中的肿瘤微环境
在一项研究未分化多形性肉瘤（UPS）的工作中，研究人员使用CopyKAT来区分恶性成纤维细胞和正常成纤维细胞。结果显示，CopyKAT成功地将成纤维细胞分为了两群，一群具有明显的CNV事件（恶性），另一群则基因组稳定（正常）。
案例二：鼻咽癌中的肿瘤演进
在对非角化性鼻咽癌（NPC）的研究中，CopyKAT被用来识别肿瘤细胞，并将其分成了两个主要的亚克隆。后续分析发现，这两个亚克隆在代谢和免疫逃逸相关的通路上存在显著差异，揭示了肿瘤内部的功能异质性。
注意事项
1. 结果并非金标准：CopyKAT是基于转录组数据的生物信息学推断，其对“肿瘤”或“正常”细胞的分类结果需要结合其他生物学证据（如关键基因标记、其他组学数据）进行综合判断，尤其是在肿瘤纯度较低或CNV信号不强的样本中。
2. 内参细胞的质量：CopyKAT自动寻找正常二倍体细胞作为内参是其核心优势，但也可能成为潜在的风险点。如果待分析的细胞群体中不包含真正的正常细胞，或者正常细胞比例极低，算法可能会错误地将一批CNV程度最轻的肿瘤细胞当作“正常”参照，导致后续所有细胞的CNV评估出现偏差。
3. 结合inferCNV进行验证：CopyKAT和inferCNV的原理不同，可以互为补充。当您对结果不确定时，可以尝试使用inferCNV（需要提供明确的正常细胞参照）进行交叉验证，观察两者结果的一致性。
常见问题解答 (FAQ)
Q1: copyKAT和inferCNV有什么区别？我应该选择哪一个？
A1: 主要区别在于是否需要手动指定正常参考细胞。
- inferCNV：需要用户明确提供一组“正常”细胞作为参考。它的优势在于，如果参考细胞非常可靠，结果会非常精确。适用于有明确正常对照组（如来自健康样本的细胞，或样本中确定为正常的非恶性细胞类型）的情况。
- copyKAT：自动从所有待分析细胞中识别最可能为正常的细胞作为内参。适用于无法确定哪些细胞是正常细胞，或者希望对整个样本进行无偏见的恶性/非恶性探索性分析的场景。
- 选择建议：如果有可靠的正常参照，两者都可以使用，inferCNV可能更经典；如果没有可靠的正常参照，强烈推荐使用copyKAT。
Q2: 为什么我的结果中有很多细胞被标记为“not defined”（未定义）？
A2: 这通常意味着这些细胞的CNV信号不够明确，算法无法以高置信度将其划分为“非整倍体”或“二倍体”。可能的原因包括：细胞本身的CNV水平较低、测序深度不足导致信号弱、或者是处于某种中间状态的细胞。
Q3: copyKAT可以用于非肿瘤研究吗？
A3: 理论上可以。任何导致大规模染色体拷贝数变化的生物学场景，如某些遗传病或细胞培养过程中的基因组不稳定性，都可以尝试使用copyKAT进行分析。但其算法是为肿瘤场景优化的，在其他场景下的解释需要更加谨慎。
参考文献
- Gao, R., et al. (2021). Delineating copy number and clonal substructure in human tumors from single-cell transcriptomes. Nature Biotechnology, 39(5), 599-608.
- Yuan, L. L., et al. (2022). Single-cell sequencing reveals the landscape of the tumor microenvironment in a skeletal undifferentiated pleomorphic sarcoma patient. Frontiers in Immunology, 13, 1019870.
- Chen, H., et al. (2023). Comprehensive single-cell transcriptomic and proteomic analysis reveals NK cell exhaustion and unique tumor cell evolutionary trajectory in non-keratinizing nasopharyngeal carcinoma. Journal of Translational Medicine, 21(1), 1-18.