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inferCNV拷贝数变异分析文档 ​

作者: SeekGene
时长: 12 分钟
字数: 3.3k 字
更新: 2025-09-11
阅读: 0 次

前言 ​

TIP

inferCNV是单细胞转录组领域用于推断肿瘤细胞拷贝数变异（Copy Number Variation, CNV）的主流生物信息学工具。它通过分析基因表达数据，识别出单个细胞或细胞群中可能存在的染色体片段扩增或缺失，从而有效区分肿瘤细胞与正常细胞，并揭示肿瘤内部的克隆异质性。

在肿瘤研究中，基因组的不稳定性是其核心特征之一，而CNV是导致这种不稳定性的重要原因。通过在单细胞水平上解析CNV，研究者可以：

  • 精确识别恶性细胞：将携带大量CNV的肿瘤细胞与混杂在肿瘤组织中的正常免疫细胞、基质细胞等区分开。
  • 探究肿瘤异质性：识别具有不同CNV特征的肿瘤亚克隆，了解肿瘤的演进过程。
  • 关联基因型与表型：将特定的CNV事件与细胞的功能状态、耐药性等表型联系起来。

本篇文档旨在为研究者提供一份详尽的inferCNV技术指南，内容涵盖其基本原理、在SeekSoulOnline云平台上的操作方法、结果解读及实战案例。

inferCNV理论基础 ​

核心原理 ​

inferCNV的核心思想是：在一个混合的细胞群体中，如果能以一组基因组稳定的细胞作为“正常”参照，就可以通过比较其他细胞的基因表达水平，来推断其是否存在染色体片段的拷贝数变化。

它基于一个关键假设：特定染色体区域的基因平均表达水平与其拷贝数成正比。如果一个区域发生扩增，该区域内基因的总体表达水平会上升；反之，如果发生缺失，则总体水平会下降。

inferCNV原理流程图

分析流程概览 ​

  1. 定义细胞组：将细胞分为两组：待分析的“观测组”（Observation）和作为基准的“参照组”（Reference）。参照组通常是已知的正常细胞，如T细胞、B细胞或成纤维细胞。
  2. 计算相对表达：计算观测组中每个细胞、每个基因相对于参照组平均表达的log2(fold change)。
  3. 平滑噪声：为了消除单个基因表达的随机波动，inferCNV会沿着染色体，使用移动窗口（如101个基因）对基因的相对表达值进行平滑处理。这一步能有效凸显由大片段CNV引起的持续性表达变化。
  4. 中心化和去噪：对数据进行中心化，使基准线回到0。同时，可以应用特定算法去除背景噪声。
  5. 结果可视化：最终通过热图展示CNV谱。热图的行是细胞，列是按染色体位置排序的基因。红色代表拷贝数增加，蓝色代表拷贝数减少。

云平台操作指南 ​

在云平台上，inferCNV分析流程被设计得直观易用，无需编写代码。

参数详解 ​

界面参数说明
任务名称本次分析的任务名称，需以英文字母开头，可包含英文字母、数字、下划线和中文。
物种选择该分析流程数据对应的物种名称，目前支持人、小鼠和大鼠。
分组因子选择要分析的细胞类型或者聚类对应的标签。例如，若想对注释好的细胞类型进行分析，则选择其对应的标签（如CellAnnotation），并与下方的“参考/分析细胞类型”配合使用。
参考细胞类型（核心参数） 多选，选择作为正常参照的细胞类型，通常为免疫细胞或正常组织的上皮细胞。可选择分组因子中的所有水平。
分析细胞类型（核心参数） 多选，选择待分析的细胞类型，通常为癌变组织的上皮细胞。可选择分组因子中除参考细胞类型外的所有水平。
基因最小平均表达量基因的平均表达量阈值，范围为(0,1]，默认是0.1。
热图图注按照所选标签为热图添加分组注释。
downsample是否对细胞进行降采样（抽取部分细胞）进行分析。
downsample_num若启用降采样，此处设置抽取的细胞数量。
备注自定义备注信息。
附加参数是否修改默认高级参数，默认不修改。
cluster_by_groups当k_obs_groups为FALSE时，可在此自定义分析细胞类型的最终聚类分群数目。
k_obs_groups选择TRUE时，会先对每个分析细胞类型各自聚类，再进行总的层次聚类。选择FALSE时，则对所有分析细胞类型进行整体聚类。
hclust_method细胞层次聚类的方法，包括ward.D、ward.D2（默认）、single、complete等。
denoise是否进行降噪处理，默认开启。
window_length基因表达平滑窗口的大小（基因个数），需要是奇数。

TIP

参考细胞的选择至关重要。错误地将肿瘤细胞选为参考，或将携带CNV的细胞混入参考集，都会严重影响结果的准确性。通常建议选择与肿瘤细胞来源不同胚层的细胞作为参考（例如，对于上皮来源的肿瘤，选择免疫细胞或基质细胞）。

操作流程 ​

  1. 进入分析模块：在云平台导航至“高级分析”模块，选择“infercnv”。
  2. 创建新任务：为您的分析任务命名，并选择要分析的样本或项目。
  3. 配置参数：根据上述指南，选择要分析的细胞类型、分组信息等。
  4. 提交任务：确认参数无误后，点击“提交”按钮，等待分析完成。
  5. 下载与查看：分析结束后，在任务列表中下载并查看生成的分析报告和结果文件。

inferCNV操作流程

结果解读 ​

inferCNV的分析报告包含丰富的图表和数据文件，以下是对核心结果的详细解读。

CNV分布总览热图 ​

这是最核心和最直观的结果，展示了所有细胞在全基因组范围内的CNV模式。

CNV分布总览热图

  • 图表解读：
    • 行：代表单个细胞，通常会按照细胞类型或CNV模式进行聚类。
    • 列：代表按染色体位置（从1号到X/Y号）排序的基因。
    • 颜色：红色表示基因表达相对于参考细胞上调，推测为拷贝数增加；蓝色表示基因表达下调，推测为拷贝数减少。
    • 上下分区：热图通常分为上下两部分，上方为参考细胞（Reference），下方为待分析细胞（Observation）。
  • 分析要点：
    • 观察参考细胞区域是否基本为中性色，这表明参考细胞选择得当。
    • 观察待分析细胞中是否存在大片段的、连续的红色或蓝色区域，这些就是推断出的CNV事件。
    • 比较不同细胞或细胞群的CNV模式，可以识别出具有不同基因组变异特征的肿瘤亚克隆。

按细胞类型/分组展示的CNV热图 ​

此图更聚焦于待分析的细胞，并按预先注释的细胞类型进行分组展示。

按细胞类型分组的CNV热图

  • 图表解读：此图只展示待分析细胞（Observation），并根据您提供的细胞类型注释对细胞（行）进行排序和颜色标记。
  • 分析要点：
    • 确认CNV事件是否主要富集在预期的肿瘤细胞类型中。
    • 评估肿瘤内部的异质性。例如，某些肿瘤细胞亚群是否携带了其他亚群没有的特定CNV事件。

CNV Score ​

为了量化每个细胞的CNV水平，inferCNV会计算一个CNV Score，反映了细胞基因组中CNV信号的整体强度。

CNV Score降维图 ​

CNV Score降维图

  • 图表解读：将CNV Score投影到UMAP或t-SNE降维图上。颜色越深，代表CNV Score越高，即该细胞的基因组越不稳定。
  • 分析要点：直观地识别出哪些细胞聚类是潜在的肿瘤细胞（通常为高CNV Score的区域）。

CNV Score小提琴图 ​

CNV Score小提琴图

  • 图表解读：按细胞类型展示每个细胞群的CNV Score分布。
  • 分析要点：定量比较不同细胞类型的CNV水平。通常，肿瘤细胞群的CNV Score会显著高于正常细胞群。

应用案例 ​

案例一：肺腺癌（文献解读） ​

研究背景 ​

在2021年发表于Science Advances的一项研究中，研究人员利用单细胞转录组技术揭示了肺腺癌的肿瘤异质性。其中，inferCNV被用于区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞，并验证其与全外显子测序（WES）结果的一致性。

分析结果 ​

文献案例图

  • 左图：展示了单个样本的inferCNV结果。以非恶性细胞（免疫细胞和基质细胞）为参考（上图），可以清晰地看到恶性细胞（中图）中存在大量与WES检测到的CNV模式（下图）高度一致的拷贝数变异事件。
  • 右图：UMAP图显示，来自不同患者的肿瘤细胞在很大程度上分开聚集，表明肿瘤间存在高度的异质性。

结论 ​

该案例表明，inferCNV能够：

  1. 有效区分肿瘤与非肿瘤细胞。
  2. 揭示肿瘤内部异质性。
  3. 结果可靠，与金标准（如WES）具有良好的一致性。

注意事项 ​

1. 参照组的选择至关重要：inferCNV分析的准确性极度依赖于一个高质量的、确定为“正常”二倍体的参照细胞群。如果参照组选择错误（例如，混入了肿瘤细胞，或选择的细胞类型本身存在生理性的基因表达差异），将会导致整个分析结果出现系统性偏差，甚至得出完全错误的结论。

2. 信噪比问题：单细胞转录组数据本身具有高噪音和高稀疏性的特点。inferCNV通过在染色体上平滑基因表达来增强信号，但这依然可能受到技术噪音的影响。对于CNV信号微弱的肿瘤，结果可能不明显或不可靠。

3. HMM模式的应用：当您需要更明确的CNV状态分类（如“扩增”、“缺失”、“中性”）而不仅仅是相对表达的热图时，可以考虑使用HMM（隐马尔可夫模型）预测模式。这有助于更客观地定义CNV区域，但对数据质量要求更高。

4. 结果不是绝对拷贝数：inferCNV展示的是相对于参照组的基因表达水平变化，它反映的是相对拷贝数，而不是绝对拷贝数（如2拷贝、3拷贝）。

常见问题解答 (FAQ) ​

Q1: 为什么我的CNV热图上，所有细胞（包括参考细胞）看起来都有CNV？

A1: 这是一个常见现象，通常是由技术噪音或不完美的参考细胞引起的。inferCNV的结果是相对的，关键在于比较“观测组”和“参照组”的模式差异。如果观测组显示出比参照组更强、更一致的大片段CNV模式，那么这些信号通常是可靠的。此外，可以尝试更换参考细胞类型或启用denoise模式来优化结果。

Q2: inferCNV能否区分杂合性缺失（loss of heterozygosity, LOH）？

A2: 不能。inferCNV是基于转录组数据的，它只能推断总的拷贝数变化（增加或减少），无法区分等位基因。LOH的精确鉴定需要基因组测序数据。

Q3: 我的分析失败了，可能是什么原因？

A3: 常见原因包括：1) 参考细胞选择错误：您在参数中选择的“参考细胞类型”在您的细胞注释数据中不存在或名称不匹配。2) 基因数量过少：经过“基因最小平均表达量”过滤后，剩余的基因太少，无法进行有效的平滑分析。3) 物种与基因ID不匹配：选择的物种（如human）与您表达矩阵中的基因ID（如小鼠基因）不符。

参考文献 ​

  1. Patel, A. P., et al. (2014). Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science, 344(6190), 1396-1401.
  2. Tirosh, I., et al. (2016). Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq. Science, 352(6282), 189-196.
  3. Xing, X., et al. (2021). Decoding the multicellular ecosystem of lung adenocarcinoma manifested as pulmonary subsolid nodules by single-cell RNA sequencing. Science Advances, 7(5), eabd9738.
  4. Kumar, M., et al. (2020). Single-cell analysis of copy-number alterations in serous ovarian cancer reveals substantial heterogeneity in both low- and high-grade tumors. Cell Cycle, 19(23), 3154-3166.
  5. Wu, F., et al. (2021). Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer. Nature Communications, 12(1), 2540.
  6. inferCNV Wiki
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