如何构建参考基因组？

作者: SeekGene

时长: 5 分钟

字数: 1.2k 字

更新: 2026-02-26

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SeekArc Tools 分析指南

准备构建基因组所需的文件

使用 SeekArc Tools 软件进行多组学分析时，需要准备物种的参考基因组序列和对应的 GTF 注释文件。请尽量使用 Ensembl 和 UCSC 来源的参考基因组，如使用 NCBI 的参考基因组，将无法计算基因与 Peak 的连接关系。相关文件格式说明如下：

基因组序列

基因组序列要求 FASTA 格式文件，染色体 ID 要与 GTF 文件第一列 seqname 一致，且 GTF 的 seqname 需要是 FASTA 文件的 Chrom ID 的子集。注意文件不可以有空行。

GTF 文件

GTF 文件格式说明如下：

seqname：序列名称，通常为染色体或 Contig ID。
source：注释来源，可以是数据库的名称（如来自 RefSeq 数据库），也可以是软件的名称（如用 GeneScan 软件预测得到），也可以为空（用 . 点号填充）。
feature：代表区间对应的特征类型，在 GTF 中，常见类型：gene、transcript、CDS、exon、start_codon、stop_codon 等。
start：feature 的起始位置。
end：feature 的终止位置。
score：表示 feature 存在和坐标的置信度，可以是一个浮点数或整数，. 表示为空。
strand：该 feature 位于参考基因组的正链（+）或者负链（-）。
frame：0 表示阅读框的第一个完整密码子位于最 5' 端，1 表示第一个完整密码子之前有一个额外的碱基，2 表示第一个完整密码子之前有两个额外的碱基。注意 frame 不是 CDS 长度除以 3 的余数，如果链是 -，则该区域的第一个碱基值为 end，因为对应的编码区将在反义链从 end 到 start。
attribute：应具有的格式是 attributes_name "attributes_values";。每个属性必须以分号结尾并且与下一个属性之间以空格分隔，并且属性的值用双引号包围。包含以下三种属性：

Attribute	含义
`gene_id "value";`	表示转录本在基因组上的基因座的唯一 ID。`gene_id` 与 value 值用空格分开，如果值为空，则表示没有对应的基因。
`transcript_id "value";`	预测转录本的唯一 ID。`transcript_id` 与 value 值用空格分开，空表示没有转录本。
`gene_type "value";`	gene 的生物学类型，`protein_coding`；`lncRNA`......

TIP

GTF 文件准备的注意事项：

GTF 文件中每个基因的 feature 列须包含 gene、transcript、exon 三个信息。
当 feature 列为 gene 时，attributes 列需要包含 gene_id，gene_type，如果没有 gene_name，则将 gene_id 的值当作 gene_name；当 feature 列为 transcript 时，attributes 列需要包含 transcript_id；当 feature 列为 exon 时，attributes 列需要包含 exon_id，否则会影响 Read 注释到多个基因时的处理。
GTF 文件同样不要有空行。
GTF 文件中线粒体基因的 gene_name 需要以 Mt- 或者 mt- 开头，否则在报告中 Mito 部分均为 0。

场景一：构建兼容不同平台单细胞数据的参考基因组

如果您既有 10X Genomics 单细胞数据，又有 SeekArc 产品的单细胞数据，推荐使用 10X Cell Ranger ARC 来构建参考基因组，SeekArc Tools 可以兼容 Cell Ranger ARC 构建的参考基因组。

请按以下格式配置 config.json 文件：

json

{
    "organism": "GRCh38",
    "genome": ["GRCh38"],
    "input_fasta": ["/path/to/GRCh38.fa"],
    "input_gtf": ["/path/to/Homo_sapiens.GRCh38.ensembl.filtered.gtf"]
}

处理基因注释文件（GTF 文件）的代码如下：

shell

/path/to/cellranger mkgtf Homo_sapiens.GRCh38.ensembl.gtf Homo_sapiens.GRCh38.ensembl.filtered.gtf \
    --attribute=gene_biotype:protein_coding \
    --attribute=gene_biotype:lncRNA \
    --attribute=gene_biotype:antisense \
    --attribute=gene_biotype:IG_LV_gene \
    --attribute=gene_biotype:IG_V_gene \
    --attribute=gene_biotype:IG_V_pseudogene \
    --attribute=gene_biotype:IG_D_gene \
    --attribute=gene_biotype:IG_J_gene \
    --attribute=gene_biotype:IG_J_pseudogene \
    --attribute=gene_biotype:IG_C_gene \
    --attribute=gene_biotype:IG_C_pseudogene \
    --attribute=gene_biotype:TR_V_gene \
    --attribute=gene_biotype:TR_V_pseudogene \
    --attribute=gene_biotype:TR_D_gene \
    --attribute=gene_biotype:TR_J_gene \
    --attribute=gene_biotype:TR_J_pseudogene \
    --attribute=gene_biotype:TR_C_gene
cellranger-arc mkref --config=config.json
cd GRCh38/genes
gunzip -dc genes.gtf.gz > genes.gtf

TIP

当 Cell Ranger ARC 构建的参考基因组与 SeekArc Tools 的 STAR 版本不兼容时，可以将 Cell Ranger ARC 的 STAR 路径指定给 SeekArc Tools，例如：--star_path /path/to/cellranger-arc-2.0.2/lib/bin/STAR。
FASTA 文件中染色体名称必须与 GTF 文件中的染色体名称相匹配。例如，FASTA 的 1 号染色体名称为 chr1，那么 GTF 文件中 1 号染色体名称也必须为 chr1。

场景二：仅有 SeekArc 产品，不需要考虑平台兼容性

构建 STAR 索引的代码如下：

shell

/demo/seekarctools/bin/STAR \
  --runMode genomeGenerate \
  --runThreadN 16 \
  --genomeDir /path/to/star \
  --genomeFastaFiles /path/to/genome.fa \
  --sjdbGTFfile /path/to/genome.gtf \
  --sjdbOverhang 149 \
  --limitGenomeGenerateRAM 17179869184
cd /path/to/fasta
bwa index genome.fa

TIP

FASTA 文件中染色体名称必须与 GTF 文件中的染色体名称相匹配。例如，FASTA 的 1 号染色体名称为 chr1，那么 GTF 文件中 1 号染色体名称也必须为 chr1。

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