单细胞 scATAC-seq & scRNA-seq 双组学高级分析：AtaCNV 分析
前言
TIP
AtaCNV 是一种专为单细胞 ATAC-seq (scATAC-seq) 数据开发的拷贝数变异 (CNV) 检测工具。通过处理单细胞染色质可及性测序数据，AtaCNV 能够高分辨率地揭示肿瘤细胞等复杂组织内部的遗传异质性。
在单细胞多组学研究中，scATAC-seq 数据不仅提供了染色质开放状态的信息，还可以通过分析基因组区域的读段数量来推断拷贝数变异 (CNV)。AtaCNV 专为单细胞 ATAC-seq 数据开发，通过处理单细胞染色质可及性测序数据，能够高分辨率地揭示肿瘤细胞等复杂组织内部的遗传异质性。适用于多组学单细胞数据中的 scATAC-seq 通道，实现对肿瘤等复杂样本中细胞拷贝数状态的自动推断与可视化。
AtaCNV 的核心功能
恶性细胞识别 区分恶性细胞与非恶性细胞。AtaCNV 利用拷贝数比率数据，计算每个细胞群组的 CNV 负荷评分，并据此将高 CNV 负荷的群组归类为恶性细胞。
高分辨率 CNV 检测 以百万碱基对 (1 Mbp) 基因组片段为单位，提供高分辨率的 CNV 检测，能够精确定量每个细胞在全基因组范围内的拷贝数状态。
多种标准化模式 提供四种标准化模式，可根据数据特点选择合适的模式，包括匹配的正常样本、已知的正常细胞、所有细胞或自动识别模式。
数据平滑与去偏差 通过对每个细胞拟合一阶动态线性模型进行平滑处理，同时执行基于细胞的局部回归，消除 GC 含量可能引起的潜在偏差。
联合分段与拷贝数推断 应用多样本 BIC-seq 算法对所有单细胞进行联合分割，估算每个细胞所获片段的拷贝数比率，并通过贝叶斯方法推断离散拷贝数状态。
本篇文档旨在为单细胞多组学研究者提供一份详尽的 AtaCNV 技术指南，内容涵盖其基本原理、在 SeekSoul Online 云平台上的操作方法、结果解读及常见问题，帮助您快速掌握并应用该工具。
AtaCNV 理论基础
核心原理
AtaCNV 分析的核心思想是：利用 scATAC-seq 数据中比对到基因组区域的读段数量作为该区域 DNA 拷贝数的代理指标，通过数据平滑、标准化、联合分段和拷贝数推断等步骤，推断出每个细胞的拷贝数变异情况。
什么是 CNV
拷贝数变异 (Copy Number Variation, CNV) 是指基因组中较大 DNA 片段在数量上的结构变异，主要表现为染色体区域的扩增 (gain) 或缺失 (loss)。正常情况下，人类细胞为二倍体（每条常染色体通常有 2 个拷贝）；当发生扩增时拷贝数超过 2，发生缺失时拷贝数低于 2。
CNV 是肿瘤等多种疾病发生和进展的重要驱动力。传统的 CNV 分析主要基于全基因组测序 (WGS) 或全外显子测序 (WES)，只能提供群体平均水平的信息。单细胞 CNV 分析则在单细胞分辨率下推断每个细胞的拷贝数状态，能够揭示组织内部不同细胞的基因组差异与异质性。
单细胞多组学 CNV 分析的两个方向
单细胞多组学数据用于 CNV 分析主要有两个方向：
- 方向一：基于 scRNA-seq 数据 - 利用基因表达信息推断 CNV，主要工具为 infercnv
- 方向二：基于 scATAC-seq 数据 - 利用读段数量推断 CNV，主要工具包括 epiAneuFinder、AtaCNV、CopyscAT
TIP
主流单细胞 ATAC-seq CNV 分析工具简介
目前，常用于 scATAC-seq 数据 CNV 检测的工具有：epiAneuFinder、CopyscAT 和 AtaCNV。本指南聚焦 AtaCNV 的详细用法。如需使用其他工具，可参考相关文档获取更多信息。
关键算法与流程
AtaCNV 的分析流程可归纳为以下几个主要步骤：
输入与初步筛选：以百万碱基对 (1 Mbp) 基因组片段的单细胞读取计数矩阵作为输入，首先根据片段的可映射性和零值数量，对细胞和基因组片段进行筛选。
数据平滑与去偏差：为降低极端噪声，AtaCNV 通过对每个细胞拟合一阶动态线性模型，对计数矩阵进行平滑处理。同时执行基于细胞的局部回归，消除 GC 含量可能引起的潜在偏差。
标准化处理：
- 若存在正常细胞：将平滑后的计数数据与正常细胞数据进行标准化比较，从而从染色质可及性等混杂因素中解卷积出拷贝数信号。
- 若缺乏正常细胞：因肿瘤单细胞数据常包含大量非肿瘤细胞，AtaCNV 先对细胞进行聚类，识别出高置信度的正常细胞群组，并以其平滑深度数据为基准做标准化。
联合分段与拷贝数推断：AtaCNV 应用多样本 BIC-seq 算法对所有单细胞进行联合分割，估算每个细胞所获片段的拷贝数比率。
CNV 群组判别与进一步推断：利用拷贝数比率数据，计算每个细胞群组的 CNV 负荷评分，并据此将高 CNV 负荷的群组归类为恶性细胞。对于肿瘤细胞，AtaCNV 进一步通过贝叶斯方法推断其离散拷贝数状态。
适用场景与主要目的
适合的样本类型：
- 肿瘤组织样本（强烈推荐）- 包含大量 CNV 事件，可揭示肿瘤异质性和亚克隆结构
- 癌前病变或发育异常样本 - 可检测早期基因组结构变异
不适合的样本类型：
- 正常健康组织 - 大多数细胞为二倍体，缺乏显著的 CNV 事件，CNV 分析意义有限
单细胞 CNV 分析的主要目的：
- 恶性细胞识别 - 区分恶性细胞与非恶性细胞（恶性细胞通常表现出大范围的、非随机的 CNV 模式）
- 肿瘤异质性解析 - 识别具有不同 CNV 特征的亚克隆群体
- 克隆进化追踪 - 通过 CNV 模式相似性推断肿瘤的克隆进化关系
云平台操作指南
在云平台上，AtaCNV 分析流程被设计得直观易用。您无需编写代码，只需通过参数配置界面即可完成分析。
分析前的准备
TIP
AtaCNV 分析的成功与否，很大程度上取决于输入数据的质量和标准化模式的选择。在开始分析前，请务必确认：
- 数据已完成预处理：您的单细胞 ATAC 数据已经过标准的质控、降维、聚类和细胞类型注释。
- 样本类型合适：AtaCNV 主要适用于肿瘤组织样本，正常健康组织的 CNV 分析意义有限。
- 数据质量要求：确保 fragment 文件与细胞条形码对齐，并完成基础 QC。低质量的 ATAC 数据会导致 CNV 检测不准确。
- 标准化模式信息：如果有匹配的正常样本或已知的正常细胞信息，建议提前准备，以获得更准确的 CNV 检测结果。
参数详解
下表详细列出了云平台 AtaCNV 分析模块的主要参数及其说明。
| 参数名称 | 说明 |
|---|---|
| 任务名称 | 本次分析的任务名称，需以英文字母开头，可包含英文字母、数字、下划线和中文。 |
| sample_name | 样本名称，需填写具体的样本名。 |
| 物种 | 物种，仅限于 human 或 mouse。 |
| 分组因子 | 细胞注释结果，meta 中对应的列名，例如 CellAnotation。 |
| 聚类结果 | 聚类结果，meta 中对应的列名，如 wknn_res.0.5_d30_l2_50。 |
| mode | 分析模式，必填。可选 “normal cells”（参考正常细胞）、“all cells”（所有细胞）、“none”（无参考）。 |
| Non-TumorCells | 用于做参考的正常细胞类型。如果选择 mode 为“normal cells”，此处需填写分组因子中的一种细胞类型（如 T_cells）；若 mode 为 “all cells” 或 “none”，则无需填写。 |
重要注意事项
TIP
- 标准化模式选择：AtaCNV 提供四种标准化模式。模式 1（匹配的正常样本）最可靠，当有匹配的非肿瘤样本时优先使用。模式 2（已知的正常细胞）当样本中的正常细胞已知时使用。模式 3（所有细胞）仅适用于肿瘤纯度较低的情况。模式 4（自动识别）当没有额外信息时使用，但准确性可能较低。
- 数据平滑：AtaCNV 会自动对数据进行平滑处理，以降低极端噪声，并消除 GC 含量可能引起的潜在偏差。
- 窗口大小：默认 1 Mbp 窗口大小适用于大多数情况，可根据数据特点调整。
- 样本类型：AtaCNV 主要适用于肿瘤组织样本，正常健康组织的 CNV 分析意义有限。
操作流程
- 进入分析模块：在云平台导航至“高级分析”模块，选择 "AtaCNV"。
- 创建新任务：为您的分析任务命名，并选择要分析的样本或项目。
- 配置参数：根据上述指南，选择要分析的细胞类型、分组信息、标准化模式等参数。
- 提交任务：确认参数无误后，点击“提交”按钮，等待分析完成。
- 查看结果：分析结束后，在任务列表中查看生成的分析报告和结果文件，包括 CNV 热图、拷贝数矩阵等。
结果解读
AtaCNV 的分析报告包含丰富的图表和数据文件，以下是对核心结果的详细解读。
拷贝数变异热图
拷贝数变异热图是 CNV 分析的核心可视化结果，全面展示了所有细胞在全基因组范围内的拷贝数状态：
图表解读
拷贝数变异热图中，每一行代表一个细胞，每一列代表基因组上的一个连续区间 (bin)。所有列按照染色体的物理位置顺序排列，从 1 号染色体依次到性染色体（若有）。每一列的颜色反映该区间在对应细胞中的拷贝数相对值：如红色表示拷贝数扩增 (gain)，蓝色表示拷贝数缺失 (loss)。热图可见相邻染色体之间的列数可能显著不同（如有的 3 列，有的 4 列，有的只有 1 列），体现了染色体长度的细微差别。
分析要点
识别恶性细胞：通过观察 CNV 模式，可以区分恶性细胞与非恶性细胞。恶性细胞通常表现出大范围的、非随机的 CNV 模式，而非恶性细胞则保持相对正常的二倍体状态。
解析肿瘤异质性：不同细胞群体可能表现出不同的 CNV 特征，这些差异反映了肿瘤内部的细胞异质性和亚克隆结构。
高分辨率检测：AtaCNV 以 1 Mbp 为单位提供高分辨率的 CNV 检测，能够精确定量每个细胞在全基因组范围内的拷贝数状态。
结果文件列表
| 文件名 | 内容说明 |
|---|---|
copy_ratio.png | 拷贝数变异热图：展示所有细胞在全基因组范围内的拷贝数状态。 |
注意事项
1. 样本类型的重要性：AtaCNV 主要适用于肿瘤组织样本，正常健康组织的 CNV 分析意义有限。在进行 CNV 分析前，请确认样本类型是否适合。
2. 标准化模式的选择：AtaCNV 提供四种标准化模式，选择合适的模式对 CNV 检测的准确性至关重要。建议优先使用模式 1（匹配的正常样本）或模式 2（已知的正常细胞），以获得更准确的结果。
3. 数据质量要求：确保输入数据的质量满足要求，低质量的 ATAC 数据会导致 CNV 检测不准确。AtaCNV 会自动进行数据平滑和去偏差处理，但仍需要高质量的输入数据。
4. 窗口大小的选择：默认 1 Mbp 窗口大小适用于大多数情况，可根据数据特点调整。较小的窗口提供更高的分辨率，但需要更高的测序深度。
5. 结果解读需谨慎：CNV 检测结果需要结合生物学知识进行解读。某些技术因素（如测序深度、批次效应）可能会影响 CNV 检测的准确性。
6. 聚类信息的使用：如果没有预存在的聚类结果，AtaCNV 将基于计数矩阵自动进行聚类。如果已有聚类结果，建议提供以提高分析的准确性。
常见问题解答 (FAQ)
Q1：如何选择合适的标准化模式？
A：AtaCNV 提供了四种标准化模式，选择建议如下：
- 模式 1 (matched normal sample)：最可靠，当有匹配的非肿瘤样本时优先使用
- 模式 2 (normal cells)：当样本中的正常细胞已知时使用，可以通过 ArchR 等工具从 scATAC-seq 数据估计标记基因表达来初步识别正常细胞
- 模式 3 (all cells)：仅适用于肿瘤纯度较低的情况，使用所有细胞构建基线
- 模式 4 (none)：当没有额外信息时使用，AtaCNV 会自动识别最可能的正常细胞，但准确性可能较低
- 建议：如果可能，尽量使用模式 1 或模式 2，以获得更准确的 CNV 检测结果
Q2：如何解释拷贝状态结果中的数值？
A：在拷贝状态推断结果中：
- 0.5：表示拷贝数缺失 (loss)，该区域在对应细胞中的拷贝数低于正常水平
- 1：表示拷贝数中性 (neutral)，即正常的二倍体状态
- 1.5：表示拷贝数扩增 (gain)，该区域在对应细胞中的拷贝数高于正常水平
- 这些数值反映了每个细胞在每个基因组区间 (bin) 的拷贝数状态，可以用于识别恶性细胞和亚克隆结构
Q3：AtaCNV 与其他 CNV 检测工具相比有什么优势？
A：AtaCNV 的主要优势包括：
- 专为 scATAC-seq 设计：充分利用了 scATAC-seq 数据的特性，直接从染色质可及性数据推断 CNV
- 高分辨率检测：以 1 Mbp 为单位提供高分辨率的 CNV 检测
- 数据平滑与去偏差：自动进行数据平滑处理，并消除 GC 含量可能引起的潜在偏差
- 多种标准化模式：提供四种标准化模式，可根据数据特点灵活选择
- 联合分段算法：应用多样本 BIC-seq 算法对所有单细胞进行联合分割，提高检测准确性
Q4：如何理解 CNV 负荷评分？
A：CNV 负荷评分是 AtaCNV 用于识别恶性细胞的重要指标：
- 高 CNV 负荷：表示该细胞群组具有大量的 CNV 事件，通常被归类为恶性细胞
- 低 CNV 负荷：表示该细胞群组具有较少的 CNV 事件，通常被归类为非恶性细胞
- CNV 负荷评分基于拷贝数比率数据计算，是区分恶性细胞与非恶性细胞的关键指标
Q5：如果没有匹配的正常样本，应该使用哪种标准化模式？
A：如果没有匹配的正常样本，可以按以下优先级选择：
- 模式 2（已知的正常细胞）：如果能够通过其他方法（如 ArchR 等工具）识别出正常细胞，优先使用此模式
- 模式 4（自动识别）：如果没有额外信息，可以使用此模式，AtaCNV 会自动识别最可能的正常细胞
- 模式 3（所有细胞）：仅适用于肿瘤纯度较低 (<50%) 的情况，一般不推荐使用
Q6：AtaCNV 可以检测哪些类型的 CNV？
A：AtaCNV 能够检测多种类型的 CNV：
- 染色体臂水平 CNV：大范围的染色体扩增或缺失
- 片段水平 CNV：中等大小的基因组片段扩增或缺失
- 局部 CNV：小范围的基因组区域扩增或缺失
- 通过 1 Mbp 窗口的分辨率，AtaCNV 能够检测从局部到染色体臂水平的各种 CNV 事件
参考资料
[1] WANG X, et al. Detecting copy-number alterations from single-cell chromatin sequencing data by AtaCNV[J]. Cell Reports Methods, 2025, 5(1).