SCENIC 分析
前言
IMPORTANT
SCENIC（Single-Cell rEgulatory Network Inference and Clustering）是单细胞转录组学中用于推断基因调控网络和细胞状态的重要工具。它能够帮助研究者理解细胞异质性背后的转录调控机制，识别细胞类型特异性的调控因子。
在单细胞研究中，我们不仅关注细胞的分类和标记基因，更希望深入了解驱动细胞状态转变的转录调控网络。SCENIC 通过整合转录因子与靶基因的共表达关系以及 DNA motif 分析，构建细胞特异性的调控网络，为解析细胞功能和发育提供重要线索。
SCENIC 的核心功能
- 基因调控网络推断：基于基因共表达模式推断转录因子与靶基因的调控关系
- 调控活性评估：通过 AUCell 算法计算每个细胞中调控子（Regulon）的活性状态
- 细胞状态识别：基于调控网络活性对细胞进行分组和注释
- 调控子特异性分析：识别在特定细胞类型中特异性活跃的调控因子
本篇文档旨在为单细胞研究者提供一份详尽的 SCENIC 技术指南，内容涵盖其基本原理、在 SeekSoul Online 云平台上的操作方法、结果解读、实战案例及常见问题，帮助您快速掌握并应用该工具。
SCENIC 理论基础
核心原理
SCENIC 的核心思想是：通过识别转录因子与其靶基因的共表达模块，并结合 DNA motif 分析验证调控关系，构建细胞特异性的基因调控网络。这一过程可以概括为三个主要步骤：
- 基因调控网络推断 (GRN inference)：使用 GENIE3 或 GRNBoost 算法基于基因表达相关性推断转录因子(TF)与潜在靶基因之间的调控关系
- 调控子修剪与富集分析 (Regulon pruning and enrichment)：利用 RcisTarget 对推断的调控关系进行 motif 富集分析，去除假阳性调控关系，形成可靠的调控子(Regulon)
- 调控子活性评估 (Regulon activity scoring)：使用 AUCell 算法计算每个细胞中每个调控子的活性状态(AUC 值)
关键算法详解
GENIE3/GRNBoost - 基因调控网络推断
- 原理：基于随机森林或梯度提升算法，计算每个转录因子与其潜在靶基因表达模式的相关性
- 输出：TF-target 调控关系及重要性得分(importance)，得分越高表示调控关系越可靠
RcisTarget - motif 富集分析
- 原理：基于已知的转录因子结合位点数据库，对推断的调控关系进行 motif 富集分析
- 作用：验证调控关系的可靠性，去除间接调控和假阳性结果
- 输出：经过修剪的调控子(Regulon)，包含 TF、靶基因及其 motif 信息
AUCell - 调控子活性评估
- 原理：基于基因集富集分析(GSEA)思想，计算每个细胞中调控子靶基因集合的富集程度
- 输出：每个细胞中每个调控子的活性得分(AUC 值)，用于后续分析
调控子特异性分析指标
RSS (Regulon Specificity Score)
- 定义：调控子在特定细胞类型中的特异性得分
- 计算：基于 AUC 值在不同细胞类型间的分布差异
- 应用：识别细胞类型特异性的关键调控因子
Z-score
- 定义：调控子在特定细胞类型中的标准化活性得分
- 计算：基于调控子在目标细胞类型与其它细胞类型间 AUC 值的差异
- 应用：量化调控子在不同细胞类型中的相对活性
云平台操作指南
在云平台上，SCENIC 分析流程被设计得直观易用。您无需编写代码，只需通过参数配置界面即可完成分析。
分析前的准备
IMPORTANT
SCENIC 分析的成功与否，很大程度上取决于输入数据的质量和生物学问题的合理性。在开始分析前，请务必确认：
- 数据已完成预处理：您的单细胞数据已经过标准的质控、降维、聚类和细胞类型注释。
- 选择了合适的细胞亚群：SCENIC 分析应在具有生物学意义的细胞亚群中进行，如已注释的细胞类型或功能相关的细胞簇。
- 确保数据规模适中：对于超过数万个细胞的数据集，建议开启 Downsample 进行分析以避免内存不足。
参数详解
下表详细列出了云平台 SCENIC 分析模块的主要参数及其说明。
| 界面参数 | 说明 |
|---|---|
| 任务名称 | 本次分析的任务名称，需以英文字母开头。 |
| 物种 | 选择该分析流程数据对应的物种名称，目前支持人、小鼠和果蝇。 |
| 分组因子 | 选择要分析的细胞类型或聚类对应的标签，例如celltype。 |
| 细胞类型 | 多选，选择要纳入分析的具体细胞类型或聚类。 |
| 拆分因子 | 多选，绘图时用于拆分不同组别的标签，如Group或Sample。 |
| Downsample | 是否对大数据集进行随机下采样。 |
| Downsample_num | 每个细胞亚群下采样保留的细胞数目。 |
| 基于历史结果分析 | 选择"Regulon 画图"，可基于已完成的分析任务重新绘图。 |
| 历史任务名称 | 选择一个已成功的 SCENIC 任务。 |
| Regulon | 在历史任务结果中，选择要重新绘图的 Regulon 名称。 |
| 备注 | 自定义备注信息。 |
重要注意事项
CAUTION
- 大数据集处理：当细胞总数超过数万时，若
Downsample参数设置为False，分析可能会因内存不足而失败。强烈建议开启Downsample进行分析。 - Metadata 规范：请确保 RDS 文件中的 metadata 列名和内容不包含中文或特殊字符（如
&），否则可能导致流程错误。 - 物种匹配：确保选择的物种与实际数据匹配，否则会影响 motif 数据库的准确性。
操作流程
- 进入分析模块：在云平台导航至"高级分析"模块，选择"scenic"。
- 创建新任务：为您的分析任务命名，并选择要分析的样本或项目。
- 配置参数：根据上述指南，选择要分析的细胞类型、分组信息等。
- 提交任务：确认参数无误后，点击"提交"按钮，等待分析完成。
- 下载与查看：分析结束后，在任务列表中下载并查看生成的分析报告和结果文件。
结果解读
SCENIC 的分析报告包含丰富的图表和数据文件，以下是对核心结果的详细解读。
结果文件列表
| 文件名 | 内容说明 |
|---|---|
adj_grn_filter.csv | 共表达模块基于 motif 分析筛选之后的表格，可查看 TFs 及其靶基因相关性。 |
reg_cxt.csv | TFs-motif 分析结果，根据 motifID 可搜索 motif logo 图片。 |
auc_mtx.csv | Regulon 在各细胞中 AUC 打分矩阵文件。 |
auc_thresholds.csv | 判定 Regulon 在细胞中是否开放的阈值。 |
binary_mtx.csv | auc_mtx.csv 文件基于 auc_thresholds 转换的二进制文件。 |
celltype_rss.csv | 进行分析的细胞群各 Regulon 特异性得分结果。 |
celltype_rss_top5reg.csv | 进行分析的细胞群筛选特异性得分 top5 Regulon。 |
celltype_z.csv | 进行分析的细胞群各 Regulon Z 值结果。 |
调控子活性可视化
AUC 热图
- 图表解读：展示各细胞中调控子活性(AUC)的热图。
- 颜色含义：红色表示高活性，蓝色表示低活性。
二值化热图
- 图表解读：基于 AUC 阈值转换的二值化热图。
- 颜色含义：黑色表示调控子处于活跃状态，白色表示调控子处于非活跃状态。
降维图
- 图表解读：在 UMAP/tSNE 图上展示调控子活性的空间分布。
- 左右图对比：
- 左图：调控子靶基因的表达水平
- 右图：调控子活性(AUC)的空间分布
应用案例
案例一：肿瘤微环境中关键转录因子的识别
- 文献：Aibar S, González-Blas CB, Moerman T, et al. Nat Methods. 2017.
- 背景：目标是识别在肿瘤浸润免疫细胞中具有特异性调控活性的转录因子（Regulon），以寻找潜在的治疗靶点或生物标志物。
- 分析策略：在注释好的免疫细胞群（如 CD8+ T 细胞、巨噬细胞）中运行 SCENIC 完整流程（GENIE3/GRNBoost → RcisTarget → AUCell），计算每个 Regulon 在细胞中的 AUC 并基于 RSS 得分筛选细胞类型特异性 Regulons；将结果与差异表达基因和临床表型（如免疫检查点表达）进行联合分析。
- 核心发现：
- 在肿瘤相关巨噬细胞中识别出若干具有高 RSS 的调控子（例如 STAT3 相关 Regulon），其 AUC 在肿瘤样本中显著上调。
- 这些 Regulon 的靶基因富集于“炎症反应”“免疫抑制”路径，与临床样本的免疫抑制表型一致。
- 部分高 RSS 的转录因子经过文献回顾也被报道与肿瘤免疫微环境调控相关，支持结果的可靠性。
案例二：发育或分化过程中调控网络的动态重构
- 文献：Van de Sande B, Flerin C, Davie K, et al. Nat Protoc. 2020.
- 背景：研究细胞命运决策期间转录调控网络如何随时间发生重构，识别负/正调控主导因子。
- 分析策略：对不同发育阶段或分化时间点的单细胞数据分别运行 SCENIC，比较不同时间点的 Regulon AUC 矩阵与 RSS 分布，关注随时间显著变化的 Regulon 并结合 motif 信息验证直接调控可能性。
- 核心发现：
- 识别到在分化早期活性高的若干 Regulon（如某些干细胞维持相关 TF），其 AUC 随分化进程下降；与此同时出现一组分化终末状态相关的 Regulon AUC 上升。
- motif 富集分析支持部分 Regulon 为直接调控关系，提示这些 TF 可能在命运决定中发挥因果作用。
案例三：药物/处理条件下 Regulon 响应的鉴定与验证
- 文献：Huynh-Thu VA, Irrthum A, Wehenkel L, et al. PLoS One. 2010.
- 背景：评估药物处理对细胞调控网络的影响，筛选出药物诱导或抑制的关键 Regulon。
- 分析策略：合并处理组与对照组数据，运行 SCENIC 并计算每个细胞的 AUC；对组间 AUC 进行差异分析，筛选显著改变的 Regulon 并通过富集分析和外部数据（如 ChIP-seq）验证其可能直接靶向关系。
- 核心发现与验证：
- 发现某些 Regulon 在处理组中 AUC 显著下降，提示药物可能通过抑制特定 TF 活性发挥作用。
- 结合 ChIP-seq 或公开数据库验证后，确认部分靶基因为该 TF 的直接靶基因，从而为药物作用机制提供分子证据。
注意事项与最佳实践
TIP
避免过度解读：SCENIC 结果是基于转录组数据的计算推断，不等于真实的调控关系。任何关键发现都需要后续的生物学实验（如 ChIP-seq、报告基因实验）来证实。
常见问题解答 (FAQ)
Q1: SCENIC 分析需要多长时间？
A: 分析时间取决于数据规模和计算资源配置。一般来说：
- 小数据集(1,000-5,000 细胞)：1-2 小时
- 中等数据集(5,000-20,000 细胞)：2-6 小时
- 大数据集(>20,000 细胞)：6-24 小时或更长 建议开启 Downsample 以加快分析速度。
Q2: NES 值和 AUC 值的意义是什么？
A:
- NES (Normalized Enrichment Score)：标准化富集分数，用于评估 motif 富集的显著性。NES>3 通常被认为是显著富集。
- AUC (Area Under the Curve)：曲线下面积，用于计算 NES，同时也反映了调控子活性水平。
Q3: RSS 和 Z-score 有什么区别？
A:
- RSS (Regulon Specificity Score)：调控子特异性得分，衡量调控子在特定细胞类型中的特异性。值越高表示调控子在该细胞类型中越特异。
- Z-score：标准化活性得分，衡量调控子在特定细胞类型中的相对活性。值越高表示调控子在该细胞类型中活性越强。
Q4: 如何验证 SCENIC 分析结果的可靠性？
A: 可通过以下方式验证结果可靠性：
- 生物学验证：结合已知文献和数据库验证关键调控关系
- 实验验证：通过 ChIP-seq、报告基因实验等方法验证关键调控因子
- 交叉验证：使用不同的数据集或分析方法验证结果一致性
参考资料
[1] AIBAR S, GONZÁLEZ-BLAS C B, MOERMAN T, et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering[J]. Nat Methods, 2017, 14(11): 1083-1086.
[2] HUYNH-THU V A, IRRTHUM A, WEHENKEL L, et al. Inferring regulatory networks from expression data using tree-based methods[J]. PLoS One, 2010, 5(9): e12776.
[3] VAN DE SANDE B, FLERIN C, DAVIE K, et al. A scalable SCENIC workflow for single-cell gene regulatory network analysis[J]. Nat Protoc, 2020, 15(7): 2247-2276.
[4] HE Y, CHEN Q, DAI J, et al. Single-cell RNA-Seq reveals a highly coordinated transcriptional program in mouse germ cells during primordial follicle formation[J]. Aging Cell, 2021, 20(7): e13424.
[5] WANG J J, GE W, ZHAI Q Y, et al. Single-cell transcriptome landscape of human fetal oocytes[J]. Cell Cycle, 2020, 19: 1425–1438.. Single-cell transcriptome landscape of ovarian cells during primordial follicle assembly in mice. PLoS Biol. 2020 Dec 22;18(12):e3001025. doi: 10.1371/journal.pbio.3001025. PMID: 33351795; PMCID: PMC7787681
- Zhao B, Jiang X. hsa-miR-518-5p/hsa-miR-3135b Regulates the REL/SOD2 Pathway in Ischemic Cerebral Infarction. Front Neurol. 2022 Apr 11;13:852013. doi: 10.3389/fneur.2022.852013. PMID: 35481271; PMCID: PMC9038098