输入与数据准备

作者: SeekGene

时长: 5 分钟

字数: 1.1k 字

更新: 2026-10-13

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甲基化 + RNA 双组学 输入

必需的输入文件

SeekSoul Methyl Tools 接受每个样本的转录组和甲基化双端 FASTQ 文件：

• 转录组 Read1 FASTQ
• 转录组 Read2 FASTQ
• 甲基化 Read1 FASTQ
• 甲基化 Read2 FASTQ

如果一个样本包含多个测序数据集，请以相同的顺序列出它们。在 Shell 模式下，使用逗号分隔文件路径。在 Nextflow 模式下，在 samplesheet 中为每个数据集提供一行。

Shell 输入参数

Shell 封装脚本 sc_methy_workflow.sh 使用以下参数：

• $1：转录组 Read1 FASTQ 路径
• $2：转录组 Read2 FASTQ 路径
• $3：甲基化 Read1 FASTQ 路径
• $4：甲基化 Read2 FASTQ 路径
• --sample：样本名称
• --outdir：输出目录
• --database_dir：参考基因组数据库目录
• --chemistry：DD-MET3 或 DD-MET5（默认值：DD-MET5）
• --core：CPU 核心数
• --filter_ch：移除包含超过 n 个 CH 甲基化位点的 reads；设置为 0 可禁用

样本命名规则

从 v2.0.0 开始，对 sample_id 和 outdir 进行更严格的验证：

• 不允许使用空格
• 类似空格的分隔符应规范为下划线
• 保持转录组和甲基化输入的样本名称一致

Nextflow Samplesheet 格式

必需的表头是：

sample_id,expression_r1,expression_r2,methylation_r1,methylation_r2

单个数据集的示例：

sample_id,expression_r1,expression_r2,methylation_r1,methylation_r2
XYRD-WTJW880,/path/to/XYRD-WTJW880-E_S1_L005_R1_001.fastq.gz,/path/to/XYRD-WTJW880-E_S1_L005_R2_001.fastq.gz,/path/to/XYRD-WTJW880-MET_S01_L001_R1_001.fastq.gz,/path/to/XYRD-WTJW880-MET_S01_L001_R2_001.fastq.gz

转录组和甲基化 FASTQ 数量不相等时的示例：

sample_id,expression_r1,expression_r2,methylation_r1,methylation_r2
WTJW969,/path/to/WTJW969_E_L003_R1.fq.gz,/path/to/WTJW969_E_L003_R2.fq.gz,/path/to/WTJW969_Met_L000_R1.fq.gz,/path/to/WTJW969_Met_L000_R2.fq.gz
WTJW969,/path/to/WTJW969_E_L004_R1.fq.gz,/path/to/WTJW969_E_L004_R2.fq.gz,/path/to/WTJW969_Met_L001_R1.fq.gz,/path/to/WTJW969_Met_L001_R2.fq.gz
WTJW969,,,/path/to/WTJW969_Met_L002_R1.fq.gz,/path/to/WTJW969_Met_L002_R2.fq.gz
WTJW969,,,/path/to/WTJW969_Met_L003_R1.fq.gz,/path/to/WTJW969_Met_L003_R2.fq.gz
WTJW969,,,/path/to/WTJW969_Met_L004_R1.fq.gz,/path/to/WTJW969_Met_L004_R2.fq.gz

Nextflow 运行参数

Nextflow 流程（nf/main.nf）使用以下关键参数：

• --samplesheet：输入样本表文件
• --database_dir：参考基因组数据库目录
• --split_fastq：根据 barcode 前 n 个碱基拆分 FASTQ，以加速分析（默认值：4）
• --filter_ch：过滤包含超过 n 个 CH 甲基化位点的 reads（默认值：2）
• --expected_cell_num：仅甲基化工作流（methy_only）细胞估计使用的预期细胞数（默认值：3000）
• --chemistry：DD-MET3 或 DD-MET5（默认值：DD-MET5）

执行环境通过 -profile 选择：

• -profile docker：使用公共容器镜像 ghcr.io/seekgene/seeksoulmethyl_docker:v1.0.0
• -profile aliyun_k8s 和 -profile aliyun_k8s_argo：使用内部镜像 seekgene-registry-vpc.cn-beijing.cr.aliyuncs.com/seekgene/seeksoulmethyl:1.1.2

参考数据库要求

--database_dir 目录应包含：

<database_dir>/
|-- bed/
|   |-- chr_len.bed
|   `-- chr_nochrM.bed
|-- fasta/
|   |-- genome.fa
|   |-- genome.fa.fai
|   `-- Bisulfite_Genome/
|-- genes/
|   `-- genes.gtf
`-- star/

流程使用的路径约定：

• star/：STAR 基因组索引
• fasta/genome.fa：基因组 FASTA
• fasta/：运行 bismark_genome_preparation 后的 Bismark 基因组文件夹
• genes/genes.gtf：基因注释
• bed/chr_len.bed：染色体大小
• bed/chr_nochrM.bed：推荐的不包含线粒体序列的染色体列表

详细的构建步骤请参阅：

• 参考基因组数据库指南
• 如何构建参考基因组数据库

代码仓库结构

克隆后，主要流程组件为：

• nf/main.nf：顶层入口。通过 --workflow 选择子工作流（rna_met、methy_only、force_cell）。
• nf/subworkflows/：工作流定义：
  • rna_met/main.nf：转录组 + 甲基化端到端处理。
  • met_only/main.nf：仅甲基化工作流。
  • forcecell/main.nf：Force-cell 工作流（使用先前输出重新计算/更新结果）。
• nf/modules/：分步处理模块：
  • step1.nf：预处理、质控、barcode 提取、转录组分析。
  • step2.nf：Bismark 比对和 BAM 排序。
  • step3.nf：按细胞拆分 BAM、ALLC 生成/合并、多尺度数据集。
  • step4.nf：汇总统计、降维、联合报告。
  • utils.nf：仅甲基化工作流的辅助工具（reads 计数和细胞估算）。
• nf/bin/：辅助脚本和资源文件（如 barcode 白名单）。
• nf/nextflow.config：执行器和资源配置。
• nf/nextflow_schema.json：流程参数 schema。
• sc_methy_workflow.sh：运行双组学分析流程的 Shell 脚本。