单细胞 scATAC-seq & scRNA-seq 双组学高级分析：TF–Peak–Gene 三元组分析

作者: SeekGene

时长: 17 分钟

字数: 4.7k 字

更新: 2026-07-10

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前言

TIP

TF–Peak–Gene 三元组（Trios）分析是单细胞多组学调控网络研究的核心功能单元。其目标是：在特定细胞状态下，系统识别"哪些 TF"通过结合"哪些调控 Peak"，最终调控了"哪些 Gene"，从而重建具有生物学解释力的 TF → Peak → Gene 调控逻辑链条。

TF–Peak–Gene 三元组将三个层面的分子证据整合为一个完整的调控单元：

• TF（调控发起者）：转录因子通过识别并结合靶 DNA 上的特征性 Motif 基序，发起特异性调控。
• Peak（调控媒介）：代表染色质开放区域，常富集于增强子、启动子等顺式调控元件；其可及性是 TF 发挥功能的物理前提。
• Gene（功能输出）：基因表达变化是上游调控事件在转录层面的最终体现。

本篇文档旨在为单细胞多组学研究者提供一份详尽的 TF–Peak–Gene 三元组技术指南，内容涵盖其基本原理、在 SeekSoul Online 云平台上的操作方法、结果解读及常见问题，帮助您快速掌握并应用该工具。

TF–Peak–Gene 三元组理论基础

核心原理

TF–Peak–Gene 三元组分析的核心思想是：整合 Peak2Gene 共变性链接、Motif–Peak 物理结合证据、TF 表达水平、TF 染色质活性（chromVAR）四个层面的多维证据，通过严苛的多维度阈值过滤，构建高置信度的 TF → Peak → Gene 调控逻辑链条。

与仅基于共表达或仅基于 Peak2Gene 相关性的方法相比，Trios 分析的优势在于引入了多重独立验证：

1. 物理结合证据（Motif–Peak 空间重叠）：通过基因组空间比对，确认 TF 的结合 Motif 是否物理上落在目标 Peak 内部。
2. 表达共变性（TF–Gene 相关性）：确认 TF 的 mRNA 表达与靶基因表达是否在细胞间具有显著相关性。
3. 活性–表达一致性（TF 活性–表达相关性）：确认 TF 的染色质结合活性（chromVAR 推断）与其 mRNA 表达水平是否一致，排除非功能性结合。
4. 活性驱动靶基因（TF 活性–靶基因相关性）：确认 TF 的染色质结合活性是否真正驱动了靶基因的转录变化。

关键算法与流程

Trios 分析包括以下关键步骤：

1. 初始三元组组装：基于 Peak2Gene 链接结果，通过基因组空间重叠比对（findOverlaps），将 Motif–Peak 结合关系与 Peak–Gene 调控链接关联，构建初始 TF–Peak–Gene 三元组
2. 多维统计检验：分别计算 TF–Gene 表达相关性、TF 活性–表达一致性、TF 活性–靶基因相关性，并计算综合调控强度评分（Linkage Score）
3. Linkage Score 计算：对同一 TF–Gene 对的所有关联 Peak，计算 $\sum (R^2\times \text{Motif Score})$，量化多点联合调控的总强度
4. 多维阈值过滤：通过 Motif 亲和力、三重相关性及显著性、Linkage Score 等多个维度的联合过滤，保留高置信度 Trios

云平台操作指南

在云平台上，TF–Peak–Gene 三元组分析流程被设计得直观易用。本分析依赖前期 Peak2Gene 分析的产出作为输入。

分析前的准备

TIP

TF–Peak–Gene 三元组分析对输入数据有特定要求。在开始分析前，请务必确认：

1. Peak2Gene 分析已完成：本分析依赖 Peak2Gene 模块输出的 Gene2PeakLinks.xls 文件作为输入。
2. Motif 注释已添加：输入的 Seurat 对象必须已完成 AddMotifs 操作，包含完整的 Motif 序列注释和基因组位置信息。
3. chromVAR 活性已计算：输入对象需包含 chromVAR 推断的 TF 活性矩阵（用于计算 TF 活性–表达一致性）。
4. 数据质量：确保 ATAC 和 RNA 数据经过充分质控，低质量数据会导致三元组推断不准确。

参数详解

下表详细列出了云平台 TF–Peak–Gene 三元组分析模块的主要参数及其说明。

参数名称	说明
任务名称	本次分析的任务名称，需以英文字母开头，可包含英文字母、数字、下划线和中文。
物种	物种信息，用于 TF 命名大小写转换及下游 Motif 数据库匹配（human 或 mouse）。
分组因子	细胞分群列名，用于热图按细胞群分组展示。
细胞类型	要分析的细胞类型。
筛选因子	样品信息的列名。
筛选对象	要分析的样品名称。
Motif Score 阈值	最小 Motif Score 阈值，用于过滤低亲和力的 TF–Peak 结合，默认为 10.0。设为 0 则不过滤。
TF-Gene 相关性阈值	最小 TF–Gene 表达相关性绝对值阈值，用于筛选表达水平上具有共变性的 TF–靶基因对，默认为 0.2。
TF 活性-表达一致性阈值	最小 TF 活性与表达相关性绝对值阈值，用于确保 TF 的染色质结合活性与其 mRNA 表达水平一致，默认为 0.2。
TF 活性-靶基因相关性阈值	最小 TF 活性与靶基因表达相关性绝对值阈值，用于确保 TF 的染色质结合活性驱动了靶基因的转录变化，默认为 0.2。
P 值阈值	最大相关性 P-value 阈值，用于三重相关性的显著性过滤，默认为 0.05。
Downsample	是否在分析前对细胞进行降采样以节省计算资源，默认为 TRUE。
Downsample_num	降采样数量，每个细胞亚群最多保留的细胞数，仅在降采样开启时生效，默认为 1000。

重要注意事项

TIP

• 依赖 Peak2Gene 输出：本分析必须以 Peak2Gene 模块的输出（Gene2PeakLinks.xls 和 output.rds）作为输入，不能独立运行。请确保 Peak2Gene 分析已正确完成。
• Motif 注释必要性：输入的 Seurat 对象必须已完成 AddMotifs 操作。如果 Motif 注释缺失，将无法建立 TF–Peak 物理结合关系，三元组组装会失败。
• chromVAR 活性必要性：TF 活性–表达一致性和 TF 活性–靶基因相关性两个维度的计算依赖 chromVAR 推断的 TF 活性矩阵。若输入对象中缺少 chromVAR 结果，这两个维度会被跳过，仅基于剩余维度进行过滤。
• 多维过滤阈值平衡：过严格的阈值可能保留的 Trios 过少；过宽松的阈值可能引入假阳性。建议先使用默认阈值，再根据结果调整。
• Linkage Score 动态阈值：平台会自动计算所有 TF–Gene 对的 Linkage Score 分布，并选取前 10%（90% 分位数）作为过滤阈值，仅保留调控效应最显著的核心网络。
• 负相关的生物学解读：TF–Gene 或 TF 活性–靶基因的"负相关"不能直接等同于"直接物理抑制"，可能是由于发育轨迹上的时间错位或 TF 激活了某个中间抑制因子（间接效应）造成的。确凿的调控方向仍需实验验证。
• 计算资源需求：Trios 分析涉及多维统计检验和全基因组 Motif 空间比对，计算量较大。对于大规模数据集，建议开启降采样。

操作流程

1. 进入分析模块：在云平台导航至"高级分析"模块，选择"TF–Peak–Gene 三元组"。
2. 创建新任务：为您的分析任务命名，并选择要分析的样本或项目。
3. 配置参数：根据上述指南，选择细胞类型、物种、各相关性阈值等参数。
4. 提交任务：确认参数无误后，点击"提交"按钮，等待分析完成。
5. 查看结果：分析结束后，在任务列表中查看生成的分析报告和结果文件，包括 Trios 三元组表格、调控散点图、共变性热图、调控网络图等。

结果解读

TF–Peak–Gene 三元组分析的分析报告包含丰富的图表和数据文件，以下是对核心结果的详细解读。

核心 TF 筛选与靶基因调控散点图

平台自动计算每个 TF 的总调控强度（Total Linkage Score），挑选排名最靠前的核心 TF（Hub TFs），并绘制 TF–靶基因调控散点图。

图表解读

• 横轴（TF 活性–靶基因相关性）：反映 TF 的染色质结合活性与靶基因表达的相关性，体现调控的方向与效应。
• 纵轴（Linkage Score）：反映综合物理调控强度，数值越高表示调控证据越确凿。
• 高亮标记：位于右上角（正相关 + 高 Linkage Score）和左上角（负相关 + 高 Linkage Score）的点为通过双阈值筛选的核心靶基因，分别代表推断的激活型和抑制型调控关系。

分析要点

1. 核心靶基因识别：同时具有高相关性绝对值和高 Linkage Score 的靶基因是该 TF 最可信的调控靶标。
2. 调控方向推断：正相关提示激活型调控，负相关可能暗示抑制型调控，但需结合生物学知识谨慎解读。

Trios 调控共变性热图

针对核心 TF，绘制其所有靶基因在单细胞层面的表达共变性热图，按细胞类型分组展示。

图表解读

• 行（基因）：该 TF 的所有高置信度靶基因
• 列（细胞）：按细胞类型分组排列，顶部颜色条标识细胞类型
• 颜色梯度：表示基因表达量的 Z-score 标准化值，红色表示高表达，蓝色表示低表达
• 聚类：行和列均进行层次聚类，揭示靶基因的共表达模块和细胞类型间的表达差异

分析要点

1. 共表达模块识别：在热图中呈现相似表达模式的靶基因群，可能参与同一生物学通路或受共同调控。
2. 细胞类型特异性：通过观察不同细胞类型间的表达差异，可识别 TF 的细胞类型特异性调控模式。

核心 TF 靶基因群的亚群特异性表达热图

针对单个核心 TF，绘制其靶基因群在各细胞亚群中的特异性表达热图，直观展示调控活性的细胞类型分布。

图表解读

• 行（基因）：该 TF 的靶基因
• 列（细胞类型）：各细胞亚群
• 颜色梯度：表示靶基因在各细胞类型中的平均表达水平（Z-score 标准化）
• 特异性模式：在某些细胞类型中高表达的靶基因群，代表该 TF 在该细胞类型中的特异性调控程序

TF–Target 调控网络图

将核心 TF 与其高置信度靶基因的调控关系以网络图形式可视化，展示 TF 的调控靶标拓扑结构。

图表解读

• 中心节点（大圆）：核心 TF
• 外围节点（小圆）：靶基因，颜色标识调控方向（红色=激活，蓝色=抑制）
• 连线：TF–靶基因调控关系，连线粗细与 Linkage Score 成正比

分析要点

1. Hub TF 识别：调控靶基因数量多且 Linkage Score 高的 TF 是调控网络的关键枢纽。
2. 调控方向分布：通过观察激活型与抑制型靶基因的比例，可推断该 TF 的整体调控模式。

全局多转录因子协同调控网络图

将所有核心 TF 及其靶基因的调控关系整合为一张全局网络图，揭示多 TF 之间的协同调控关系。

图表解读

• 节点：大节点表示 TF，小节点表示靶基因；不同 TF 用不同颜色区分
• 连线：TF–靶基因调控关系
• 共享靶基因：被多个 TF 共同调控的靶基因位于网络中心，可能处于多条调控通路的交汇处

分析要点

1. 协同调控识别：共同调控同一靶基因群的多个 TF 可能形成协同调控模块。
2. 调控枢纽：处于网络中心、被多个 TF 共同靶向的基因，可能是关键的细胞命运决定基因。
3. 功能冗余性：多个 TF 靶向相同靶基因群，可能暗示功能冗余或备份调控机制。

结果文件列表

文件名	内容说明
TF_Peak_Gene_Trios_all.txt	完整三元组表格，包含所有初始组装的 TF–Peak–Gene 组合及其多维统计指标。
TF_Peak_Gene_Trios_all_filter.txt	高置信度三元组表格，经过多维阈值过滤后的核心调控关系。
TF_Targets_Scatters/	核心 TF 靶基因调控散点图目录（每个 TF 一个 PDF/PNG）。
TF_Targetcds_Heatmaps/	核心 TF 靶基因共变性热图目录（每个 TF 一个 PDF/PNG）。
TF_Targets_Networks/	核心 TF 调控网络图目录（每个 TF 一个 PDF/PNG）。
All_TFs_network.pdf/png	全局多转录因子协同调控网络图。

注意事项

1. 依赖上游分析：TF–Peak–Gene 三元组分析必须依赖 Peak2Gene 模块的输出结果。请确保先完成 Peak2Gene 分析，并将 Gene2PeakLinks.xls 和 output.rds 作为输入传入。

2. Motif 注释和 chromVAR 活性的必要性：输入的 Seurat 对象必须包含 Motif 注释（AddMotifs）和 chromVAR TF 活性矩阵。缺少这两者会导致部分维度无法计算，影响过滤效果。

3. 多维阈值平衡：Motif Score、三重相关性及 Linkage Score 等多个阈值共同决定最终保留的 Trios 数量。建议先使用默认阈值，再根据结果质量调整。过严格的阈值可能丢失真实调控关系，过宽松则可能引入假阳性。

4. Linkage Score 的动态阈值：平台采用自适应动态阈值（90% 分位数）进行 Linkage Score 过滤，确保保留的 Trios 始终是调控效应最显著的头部核心网络。

5. 负相关解读需谨慎：TF–Gene 或 TF 活性–靶基因的"负相关"不能直接等同于"直接物理抑制"。它可能是由于发育轨迹上的时间错位、TF 激活了某个中间抑制因子（间接效应）等造成的。确凿的调控方向仍需实验验证。

6. 细胞数量要求：TF–Gene 相关性和 TF 活性–靶基因相关性的计算需要足够的细胞数量以保证统计功效。细胞过少会导致相关性估计不稳定。

7. 结果解读需结合生物学知识：Trios 分析推断的是统计学上的调控关系，需要结合已知的生物学知识和文献验证。推断出的调控关系可能是直接或间接的，也可能存在细胞状态依赖的调控模式。

常见问题解答（FAQ）

Q1：Trios 分析与 Peak2Gene 分析有什么区别？

A：两者关注的调控层面不同，但结果互补：

• Peak2Gene：仅关注 Peak 与 Gene 之间的共变性关系，回答"哪些 Peak 可能调控哪些 Gene"
• Trios：在 Peak2Gene 基础上进一步整合 TF–Peak 物理结合、TF 表达、TF 活性等多维证据，回答"哪些 TF 通过哪些 Peak 调控了哪些 Gene"
• 整合关系：Trios 依赖 Peak2Gene 的输出作为输入，是 Peak2Gene 分析的下游延伸

Q2：为什么我的分析结果中高置信度 Trios 数量很少？

A：可能的原因包括：

• 细胞数量过少：导致相关性估计不稳定，建议增加细胞数量
• 过滤阈值过严格：尝试降低相关性阈值（如 0.2 → 0.1）或降低 Motif Score 阈值
• chromVAR 活性缺失：若输入对象中缺少 chromVAR 结果，活性–表达一致性和活性–靶基因相关性两个维度会被跳过，过滤效果会受影响
• Motif 注释不完整：确保输入对象已完成 AddMotifs 操作

Q3：Linkage Score 是怎么计算的？

A：Linkage Score 计算公式为：$\sum (R^2\times \text{Motif Score})$，其中：

• $R^2$：Peak2Gene 相关性（peak_gene_cor）的平方，即决定系数，代表 Peak 可及性能解释靶基因表达变异的比例
• Motif Score：TF 在该 Peak 上的序列结合亲和力打分
• $\sum$：对同一 TF–Gene 对的所有关联 Peak 求和，量化多点联合调控的总强度

Linkage Score 越高，代表该 TF 调控目标基因的综合物理证据越确凿。

Q4：负相关 Trios 是否代表抑制型调控？

A：不能直接下结论。负相关可能由以下原因导致：

• TF 确实直接抑制靶基因转录
• TF 激活了某个中间抑制因子，间接导致靶基因下调（间接效应）
• 发育轨迹上的时间错位，TF 与靶基因处于分化的不同阶段
• 统计噪声或批次效应

建议结合已知生物学知识和文献综合判断，必要时进行实验验证。

Q5：Trios 分析结果可以与哪些下游分析整合？

A：Trios 结果可以与多种分析整合：

• SCENIC+ 分析：将 Trios 的高置信度调控关系与 SCENIC+ 推断的 eRegulon 进行交叉验证
• Motif 富集分析：将 Trios 涉及的 Peak 集合进行 Motif 富集，验证 TF 结合位点的活性
• 差异分析：将高置信度 Trios 与差异表达/差异可及性分析结果整合，锁定疾病或状态特异性的核心调控因子
• 功能富集分析：对 Trios 涉及的靶基因进行 GO/KEGG 富集，揭示调控的生物学功能

方法

Trios 方法下载

参考资料

[1] GRANJA J M, KLEMM S, MCGEOUGH L J, et al. Single-cell multiomic analysis identifies regulatory programs in mixed-phenotype acute leukemia[J]. Nature biotechnology, 2019, 37(12): 1458-1465.

[2] STUART T, SRIVASTAVA A, MADAD S, et al. Single-cell chromatin state analysis with Signac[J]. Nature methods, 2021, 18(11): 1333-1341.

[3] SCHEP A N, WU B, BUENROSTRO J D, et al. chromVAR: inferring transcription-factor-associated accessibility chromatin using single-cell data[J]. Genome biology, 2017, 18: 180.