如何构建参考基因组

作者: SeekGene

时长: 5 分钟

字数: 1.3k 字

更新: 2026-01-21

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SeekArc Tools

准备构建基因组所需的文件

使用 SeekArc Tools v1.0.0 软件进行多组学分析时，需要准备物种的参考基因组序列和对应的 GTF 注释文件。请尽量使用 Ensembl 和 UCSC 来源的参考基因组，如使用 NCBI 的参考基因组，将无法计算基因与 Peak 的连接关系。相关文件格式说明如下：

基因组序列

基因组序列要求 FASTA 格式文件，染色体 ID 要与 GTF 文件第一列 seqname 一致，且 GTF 的 seqname 需要是 FASTA 文件的染色体 ID 的子集。注意文件不可以有空行。

GTF 文件

GTF 文件格式说明如下：

1. seqname: 序列名称，通常为染色体或 Contig ID。
2. source: 注释来源，可以是数据库的名称，比如来自 RefSeq 数据库，也可以是软件的名称，比如用 GeneScan 软件预测得到，当然，也可以为空，用 . 点号填充。
3. feature: 代表区间对应的特征类型，在 GTF 中，常见类型：gene、transcript、CDS、exon、start_codon、stop_codon 等。
4. start: feature 的起始位置。
5. end: feature 的终止位置。
6. score: 表示 feature 存在和坐标的置信度，可以是一个浮点数或整数，"." 表示为空，就是不需要。
7. strand: 该 feature 位于参考基因组的正链 (+) 或者负链 (-)。
8. frame: 0 表示阅读框的第一个完整密码子位于最 5' 端，1 表示第一个完整密码子之前有一个额外的碱基，2 表示第一个完整密码子之前有两个额外的碱基。注意 frame 不是 CDS 长度除以 3 的余数，如果链是 '-'，则该区域的第一个碱基值为 'end'，因为对应的编码区将在反义链从 end 到 start。
9. attribute: 应具有的格式是 attributes_name "attributes_values"; 每个属性必须以分号结尾并且与下一个属性之间以空格分隔，并且属性的值用双引号包围。包含以下三种属性：

attribute	含义
gene_id "value";	表示转录本在基因组上的基因座的唯一 ID。gene_id 与 value 值用空格分开，如果值为空，则表示没有对应的基因。
transcript_id "value";	预测转录本的唯一 ID。transcipt_id 与 value 值用空格分开，空表示没有转录本
gene_type "value";	gene 的生物学类型，protein coding；lncRNA......

GTF 文件准备的注意事项：

• GTF 文件中每个基因的 feature 列须包含 gene、transcript、exon 三个信息。
• 当 feature 列为 'gene' 时，attributes 列需要包含 gene_id，gene_type，如果没有 gene_name，则将 gene_id 的值当作 gene_name；当 feature 列为 'transcript' 时，attributes 列需要包含 transcript_id；当 feature 列为 'exon' 时，attributes 列需要包含 exon_id，否则会影响 Reads 注释到多个基因时的处理。
• GTF 文件同样不要有空行。
• GTF 文件中线粒体基因的 gene_name 需要以 "Mt-" 或者 "mt-" 开头，否则在报告中 mito 部分均为 0。

场景一：构建兼容不同平台单细胞数据的参考基因组

如果您既有 10X Genomics 单细胞数据，又有 SeekArc 产品的单细胞数据，推荐使用 10X Cell Ranger ARC 来构建参考基因组，SeekArc Tools v1.0.0 可以兼容 Cell Ranger ARC 构建的参考基因组。

请按以下格式配置 config.json 文件：

{
    "organism": "GRCh38",
    "genome": ["GRCh38"],
    "input_fasta": ["/path/to/GRCh38.fa"],
    "input_gtf": ["/path/to/Homo_sapiens.GRCh38.ensembl.filtered.gtf"]
}

处理基因注释文件（GTF 文件）的代码如下：

/path/to/cellranger mkgtf Homo_sapiens.GRCh38.ensembl.gtf Homo_sapiens.GRCh38.ensembl.filtered.gtf \
    --attribute=gene_biotype:protein_coding \
    --attribute=gene_biotype:lncRNA \
    --attribute=gene_biotype:antisense \
    --attribute=gene_biotype:IG_LV_gene \
    --attribute=gene_biotype:IG_V_gene \
    --attribute=gene_biotype:IG_V_pseudogene \
    --attribute=gene_biotype:IG_D_gene \
    --attribute=gene_biotype:IG_J_gene \
    --attribute=gene_biotype:IG_J_pseudogene \
    --attribute=gene_biotype:IG_C_gene \
    --attribute=gene_biotype:IG_C_pseudogene \
    --attribute=gene_biotype:TR_V_gene \
    --attribute=gene_biotype:TR_V_pseudogene \
    --attribute=gene_biotype:TR_D_gene \
    --attribute=gene_biotype:TR_J_gene \
    --attribute=gene_biotype:TR_J_pseudogene \
    --attribute=gene_biotype:TR_C_gene
cellranger-arc mkref --config=config.json
cd GRCh38/genes
gunzip -dc genes.gtf.gz > genes.gtf

IMPORTANT

• 当 Cellranger-arc 构建的参考基因组与 SeekArc Tools v1.0.0 的 STAR 版本不兼容时，可以将 Cellranger-arc 的 STAR 路径指定给 SeekArc Tools v1.0.0，例如：--star_path /path/to/cellranger-arc-2.0.2/lib/bin/STAR。
• FASTA 文件中染色体名称必须与 GTF 文件中的染色体名称相匹配。例如，FASTA 的 1 号染色体名称为 chr1，那么 GTF 文件中 1 号染色体名称也必须为 chr1。

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场景二：仅有 SeekArc 产品，不需要考虑平台兼容性

构建 STAR 索引的代码如下：

/demo/seekarctools/bin/STAR \
  --runMode genomeGenerate \
  --runThreadN 16 \                        
  --genomeDir /path/to/star \             
  --genomeFastaFiles /path/to/genome.fa \  
  --sjdbGTFfile /path/to/genome.gtf \      
  --sjdbOverhang 149 \                     
  --limitGenomeGenerateRAM 17179869184   
cd /path/to/fasta
bwa index genome.fa

IMPORTANT

• FASTA 文件中染色体名称必须与 GTF 文件中的染色体名称相匹配。例如，FASTA 的 1 号染色体名称为 chr1，那么 GTF 文件中 1 号染色体名称也必须为 chr1。