SeekSoul Tools v1.3.0

作者: SeekGene

时长: 36 分钟

字数: 9.2k 字

更新: 2025-07-25

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SeekSoul Tools v1.3.0 是寻因生物开发的一套处理单细胞转录组数据的软件，目前该软件包含五个模块:

rna模块：用于识别细胞标签barcode，比对定量，得到可用于下游分析的细胞表达矩阵，之后进行细胞聚类和差异分析，该模块不仅支持SeekOne®系列试剂盒产出数据，还可通过对barcode的描述，支持多种自定义设计结构；
fast模块：该模块专门针对SeekOne® DD单细胞全序列转录组试剂盒产出的数据，用于对数据进行barcode提取，双端reads比对，定量，以及全序列数据特有的指标统计。
vdj模块：该模块用于专门针对SeekOne® DD单细胞免疫分析试剂盒产出的数据，用于组装、过滤和注释免疫受体；
multivdj模块：该模块用于对5'RNA和VDJ数据进行联合分析；
utils模块：该模块包含其他小工具。

软件下载

SeekSoul Tools v1.3.0

Download-SeekSoulTools - md5: 21b19d5f10022f0d8caf1a1a9c3f66c6

wget下载方式

shell

wget -c -O seeksoultools.1.3.0.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/seeksoultools/seeksoultools.1.3.0.tar.gz"

curl下载方式

shell

curl -C - -o seeksoultools.1.3.0.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/seeksoultools/seeksoultools.1.3.0.tar.gz"

软件安装

IMPORTANT

安装前请确保系统环境满足要求，并具有足够的磁盘空间。初次初始化可能需要较长时间。

安装：

shell

# 解压
tar zxf seeksoultools.1.3.0.tar.gz
cd seeksoultools.1.3.0
# 设置环境变量
export PATH=`pwd`:$PATH
echo "export PATH=$(pwd):\$PATH" >> ~/.bashrc

# 初始化和安装验证，初次执行所需时间稍长
`pwd`/seeksoultools --version

使用教程

rna模块

数据准备

NOTE

在开始分析之前，请确保已准备好以下必需文件：

测序数据（FASTQ格式）
对应物种的参考基因组
基因注释文件（GTF格式）

测试数据下载

测试数据 - md5: 3d15fcfdefc0722735d726f40ec4e324（物种：人）

wget下载方式

shell

wget -c -O demo_dd.tar "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/demodata/demo_dd.tar"
# decompress
tar xf demo_dd.tar

curl下载方式

shell

curl -C - -o demo_dd.tar "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/demodata/demo_dd.tar"
# decompress
tar xf demo_dd.tar

参考基因组下载和构建

Download-human-reference-GRCh38 - md5: 5473213ae62ebf35326a85c8fba6cc42

Download-mouse-reference-mm10 - md5: 5c7c63701ffd7bb5e6b2b9c2b650e3c2

wget下载方式

shell

wget -c -O GRCh38.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/GRCh38.tar.gz"
# decompress
tar -zxvf GRCh38.tar.gz
wget -c -O mm10.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/mm10.tar.gz"

tar -zxvf mm10.tar.gz

curl下载方式

shell

curl -C - -o GRCh38.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/GRCh38.tar.gz"
# decompress
tar -zxvf GRCh38.tar.gz

curl -C - -o mm10.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/mm10.tar.gz"

tar -zxvf mm10.tar.gz

参考基因组的构建可以参考如何构建参考基因组？

运行

运行示例

TIP

SeekSoulTools v1.3.0提供了多种运行模式，以下示例涵盖了最常见的使用场景。建议根据实际需求选择合适的参数组合。

示例1：基本用法

为分析设置必要的配置文件，包括样本数据的路径、试剂类型、基因组索引、GTF等。使用以下命令运行SeekSoulTools：

shell

seeksoultools rna run \
--fq1 /path/to/demo_dd/demo_dd_S39_L001_R1_001.fastq.gz \
--fq2 /path/to/demo_dd/demo_dd_S39_L001_R2_001.fastq.gz \
--samplename demo_dd \
--genomeDir /path/to/GRCh38/star \
--gtf /path/to/GRCh38/genes/genes.gtf \
--chemistry DDV2 \
--core 4 \
--include-introns

示例2：指定其他版本STAR进行分析

为了在分析中使用特定版本的STAR，并确保与该版本生成的--genomeDir兼容，你可以使用以下命令运行SeekSoulTools，并指定所需版本的STAR的路径：

shell

seeksoultools rna run \
--fq1 /path/to/demo_dd/demo_dd_S39_L001_R1_001.fastq.gz \
--fq2 /path/to/demo_dd/demo_dd_S39_L001_R2_001.fastq.gz \
--samplename demo_dd \
--genomeDir /path/to/GRCh38/star \
--gtf /path/to/GRCh38/genes/genes.gtf \
--chemistry DDV2 \
--core 4 \
--include-introns \
--star_path /path/to/cellranger-5.0.0/lib/bin/STAR

示例3：一个样本有多组fastq数据

如果一个样本有多个FASTQ数据集，你可以在运行SeekSoulTools时提供与该样本相关的所有FASTQ文件的路径。以下是一个示例命令：

shell

seeksoultools rna run \
--fq1 /path/to/demo_dd_S39_L001_R1_001.fastq.gz \
--fq1 /path/to/demo_dd_S39_L002_R1_001.fastq.gz \
--fq2 /path/to/demo_dd_S39_L001_R2_001.fastq.gz \
--fq2 /path/to/demo_dd_S39_L002_R2_001.fastq.gz \
--samplename demo \
--genomeDir /path/to/GRCh38/star \
--gtf /path/to/GRCh38/genes/genes.gtf \
--chemistry DDV2 \
--core 4 \
--include-introns

示例4：自定义R1结构

要自定义 Read 1 (R1) FASTQ文件的结构，可以使用以下命令：

shell

seeksoultools rna run \
--fq1 /path/to/demo_dd_S39_L001_R1_001.fastq.gz \
--fq2 /path/to/demo_dd_S39_L001_R2_001.fastq.gz \
--samplename demo \
--genomeDir /path/to/GRCh38/star \
--gtf /path/to/GRCh38/genes/genes.gtf \
--barcode /path/to/utils/CLS1.txt \
--barcode /path/to/utils/CLS2.txt \
--barcode /path/to/utils/CLS3.txt \
--linker /path/to/utils/Linker1.txt \
--linker /path/to/utils/Linker2.txt \
--structure B9L12B9L13B9U8 \
--core 4 \
--include-introns

B9L12B9L13B9U8表示read1的结构为：9个碱基barcode+12个碱基linker+9个碱基barcode+13个碱基linker+9个碱基barcode+9碱基UMI，整体cellbarcode有3段，共27个碱基(9*3)，UMI为8个碱基
使用--barcode依次指定3段barcode，--linker依次指定2段linker。

软件参数说明

IMPORTANT

以下参数对分析结果有重要影响，请根据实验设计和数据特点谨慎选择：

--chemistry：必须与使用的试剂盒类型完全匹配
--include-introns：影响基因表达定量策略
--expectNum：影响细胞数量的预估

参数	参数说明
--fq1	R1 fastq数据路径。
--fq2	R2 fastq数据路径。
--samplename	样本名称，会在outdir目录下创建以样本名称命名的目录。仅支持数字，字母和下划线。
--outdir	结果输出目录。默认值：./。
--genomeDir	STAR构建的参考基因组路径, 版本需要与SeekSoulTools使用的STAR一致。
--gtf	相应物种的gtf路径。
--core	分析使用的线程数。
--chemistry	试剂类型，每种对应一组`--shift`、`--pattern`、 `--structure`、`--barcode`和`--sc5p`的组合，可选值：DDV2，DD5V1，MM，MM-D； DDV2 对应SeekOne(R) DD单细胞3'转录组试剂盒； DD5V1 对应SeekOne(R) DD单细胞5'转录组试剂盒； MM 对应SeekOne(R) MM单细胞转录组试剂盒； MM-D 对应SeekOne(R) MM大孔径高通量转录组试剂盒
--skip_misB	barcode不允许碱基错配，默认允许一个碱基错配。
--skip_misL	linker不允许碱基错配，默认允许一个碱基错配。
--skip_multi	舍弃能纠错为多个白名单barocde的reads，默认纠错为比例最高的barcode。
--expectNum	预估的捕获细胞数目。
--forceCell	当正常分析得到的细胞数⽬不理想时，选⽤此参数，后⾯加⼀个预期的数值N，SeekSoulTools软件会按照UMI从⾼到低取前N个细胞。
--include-introns	不启用时，只会选择exon reads⽤于定量；启用时，intron reads也会⽤于定量。
--star_path	指定其他版本的STAR路径进行比对，版本需要与`--genomeDir`版本兼容，默认的`--star_path`为环境下的STAR。

结果文件说明

以下是输出目录结构：每一行代表一个文件或文件夹，用 "├──" 表示，数字表示三个重要的输出文件。

shell

./
├── demo_report.html                          1
├── demo_summary.csv                          2
├── demo_summary.json                    
├── step1                                
│   └──demo_2.fq.gz                      
├── step2                               
│   ├── featureCounts                   
│   │   └── demo_SortedByName.bam      
│   └── STAR                            
│       ├── demo_Log.final.out          
│       └── demo_SortedByCoordinate.bam  
├── step3
│   ├── filtered_feature_bc_matrix            3
│   └── raw_feature_bc_matrix          
└──step4                                
    ├── FeatureScatter.png              
    ├── FindAllMarkers.xls               
    ├── mito_quantile.xls               
    ├── nCount_quantile.xls             
    ├── nFeature_quantile.xls           
    ├── resolution.xls                   
    ├── top10_heatmap.png               
    ├── tsne.png                         
    ├── tsne_umi.png                    
    ├── tsne_umi.xls                     
    ├── umap.png                        
    └── VlnPlot.png

样本的html报告
样本的csv格式质控信息
算法判定是细胞的稀疏矩阵

处理过程

step1: barcode/UMI提取

CAUTION

barcode和UMI的准确提取对后续分析至关重要。请注意：

确保提供正确的结构设计参数
注意错配参数的设置
监控数据质量指标

SeekSoulTools根据不同的Read1的结构设计和参数对barcode/UMI进行提取和处理，对Read1和Read2进行过滤，输出新的fastq文件。

结构设计和描述

NOTE

以下是Read1结构设计中使用的基本符号说明：

B: barcode部分碱基
L: linker部分碱基
U: UMI部分碱基
X: 其他任意碱基，用于占位

B8L8B8L10B8U8： MM0

B17U12：

TIP

MM设计下，为了增加Linker部分在测序时碱基均衡性，加入了1-4 bp的移码碱基，即anchor，anchor决定了barcode的起始位置。

数据流程

确定anchor

对于Read1有错位设计的数据（MM试剂产出的数据），SeekSoulTools尝试在Read1序列前7个碱基中寻找anchor序列，以确定后续barcode等的起始。若没找到anchor序列，此条read以及对应的R2被认为是无效read。

Barcode和Linker矫正

在确定barcode的起始后，根据结构设计，取出相应序列。当取出的barcode序列在白名单中时，我们认为它是有效barcode，计入有效barcode的reads数量；当barcode不在白名单中时，我们认为它是无效barcode。

测序过程中，有一定几率发生测序错误。在提供有白名单的情况下，SeekSoulTools可以尝试barcode矫正。在启用矫正时，当无效barcode一个碱基错配（一个hamming distance）的序列存在于白名单中：

只有唯一一个序列存在于白名单中：我们将这个无效barcode矫正为白名单中barcode；
有多个序列存在于白名单中：我们将这个无效barcode改为read支持数量最多的序列；

Linker的处理与Barcode相同。

接头和PolyA序列剪切

在转录组产品中，Read2的末端有可能会出现polyA tail，建库时可能引入的接头序列。我们对这些污染序列进行切除，剪切完的read2长度需要大于设定的最小长度来保证有足够的信息，准确比对到基因组的位置。如果剪切完成后的read2长度小于最小长度，我们认为这条read为无效read。

经过上述处理后，数据组成如下图：

step1

total: 总共的reads数目
valid: 不需要矫正和矫正成功的reads数目
B_corrected: 矫正成功的reads数目
B_no_correction: 错误Barcode的reads数目
L_no_correction: 错误Linker的reads数目
no_anchor：不包含anchor的reads数目
trimmed: 进行过剪切的reads数目
too_short: 进行过剪切后长度小于60bp的reads数目

指标之间的关系如下：

total = valid + no_anchor + B_no_correction + L_no_correction

输出fastq的reads数：total_output = valid - too_short

step2: 进行比对并找到比对基因

IMPORTANT

比对质量直接影响下游分析结果。请特别关注：

STAR版本与参考基因组索引的兼容性
比对参数的选择
外显子和内含子区域的比对比例

序列比对

使用STAR比对软件将处理后的R2比对到参考基因组上。
使用QualiMap软件和转录本注释文件GTF，统计reads比对外显子、内含子和基因间区等的比例。
使用featureCounts将比对上的read注释到基因上，可以选择不同的注释规则，如链方向性和定量的feature。当使用外显子定量时，当read超过50%碱基比对到外显子区域时，认为该read来源于此外显子以及外显子对应的基因；当使用转录本定量时，当read超过50%碱基比对到转录本区域时，认为该read来源于此转录本以及转录本对应的基因。

经过上述处理后，有如下数据指标：

Reads Mapped to Genome: 比对到参考基因组上的reads占所有reads的比例（包括只有一个比对位置和多个比对位置的reads）
Reads Mapped Confidently to Genome: 在参考基因组上只有一个比对位置的reads占所有reads的比例
Reads Mapped to Intergenic Regions：比对到基因间隔区reads占所有reads的比例
Reads Mapped to Intronic Regions：比对到内含子reads占所有reads的比例
Reads Mapped to Exonic Regions：比对到外显子reads占所有reads的比例

step3: 定量

WARNING

定量过程中的关键注意事项：

UMI去重对表达量估计有重要影响
细胞判定的阈值设置需要根据实验设计调整
建议仔细检查细胞数量是否符合预期

UMI定量

SeekSoulTools以barcode为单位提取featureCounts输出的bam数据，统计注释到基因的UMI和UMI对应的reads数：

过滤掉对应UMI为单个重复碱基的reads，例如UMI为TTTTTTTT
当read注释到多个基因，在有唯一外显子的注释时，为有效read，其他情形下都过滤掉

UMI矫正

NOTE

测序过程中，UMI也有一定概率出现测序错误。SeekSoulTools默认使用UMI-tools的adjacency方法对UMI进行矫正。

Schematic from UMI-tools 图片来源: https://umi-tools.readthedocs.io/en/latest/the_methods.html

细胞判定

IMPORTANT

SeekSoulTools使用以下步骤判定barcode是否为细胞：

对所有barcode按照对应的UMI数由高到低排序
取预估细胞的1%位置的barcode的UMI数除以10为阈值
barcode的UMI数大于阈值的判定为细胞
barcode的UMI小于阈值但大于300时，使用DropletUtils分析
不符合上述条件的为背景

TIP

DropletUtils分析方法：

假设UMI数量低于100的barcode为empty droplet
根据每个droplet相同基因的UMI数总和计算背景RNA表达谱
通过统计学检验识别显著差异的细胞

经过上述处理后，有如下数据指标：

Estimated Number of Cells: 算法判定的细胞总数
Fraction Reads in Cells: 判定为细胞的reads占所有参与定量的reads的比例
Mean Reads per Cell: 细胞的平均reads数，总reads数/判定的细胞数
Median Genes per Cell: 判定为细胞的barcode中基因数的中位数
Median UMI Counts per Cell: 判定为细胞的barcode中UMI数的中位数
Total Genes Detected: 所有细胞检测到基因数量
Sequencing Saturation: 饱和度，1 - UMI总数/reads总数

step4: 后续分析

经过上述定量，得到表达矩阵后，我们可以进行下一步的分析。

Seurat分析流程

使用Seurat计算线粒体含量，细胞中UMI总数，细胞中基因总数。之后对矩阵进行归一化、寻找高变基因、降维聚类之后寻找差异基因。

fast模块

NOTE

fast模块专门用于处理SeekOne® DD单细胞全序列转录组数据，具有以下特点：

支持双端reads比对
提供全序列特有的指标统计
v1.3.0版本去掉了reads1umi后17bp低质量碱基，提高了数据质量

数据准备

测试数据下载

测试数据 - md5: 878de2833feea2deb7d79224409d0d09（物种：人）

wget下载方式

shell

wget -c -O cellline.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/demodata/cellline.tar.gz"
# decompress
tar zxf cellline.tar.gz

curl下载方式

shell

curl -C - -o cellline.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/demodata/cellline.tar.gz"
# decompress
tar zxf cellline.tar.gz

参考基因组下载和构建

Download-human-reference-GRCh38 - md5: 5473213ae62ebf35326a85c8fba6cc42

Download-hg38-rRNA - md5: 9949f6cea38633daf1d5bf1a2b976488

Download-mouse-reference-mm10 - md5: 5c7c63701ffd7bb5e6b2b9c2b650e3c2

Download-mouse-rRNA - md5: 7a1c2d573086fa9240c8978bb8a859f7

wget下载方式

shell

wget -c -O GRCh38.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/GRCh38.tar.gz"
# decompress
tar -zxvf GRCh38.tar.gz

wget -c -O hg38_rRNA.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/hg38_rRNA.tar.gz"
tar -zxvf hg38_rRNA.tar.gz

wget -c -O mm10.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/mm10.tar.gz"
tar -zxvf mm10.tar.gz

wget -c -O mouse_rRNA.tar.gz "http://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/mm10_rRNA.tar.gz"
tar -zxvf mouse_rRNA.tar.gz

curl下载方式

shell

curl -C - -o GRCh38.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/GRCh38.tar.gz"
# decompress
tar -zxvf GRCh38.tar.gz

curl -C - -o hg38_rRNA.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/hg38_rRNA.tar.gz"
tar -zxvf hg38_rRNA.tar.gz

curl -C - -o mm10.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/mm10.tar.gz"
tar -zxvf mm10.tar.gz

curl -C - -o mouse_rRNA.tar.gz "http://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/mm10_rRNA.tar.gz"
tar -zxvf mouse_rRNA.tar.gz

参考基因组的构建可以参考如何构建参考基因组？

运行

运行示例

示例1：单细胞全序列转录组数据

为分析设置必要的配置文件，包括样本数据的路径、试剂类型、基因组索引、GTF等。使用以下命令运行SeekSoulTools：

shell

seeksoultools fast run \
--fq1 /path/to/cellline/cellline_R1.fq.gz \
--fq2 /path/to/cellline/cellline_R2.fq.gz \
--samplename demo \
--genomeDir /path/to/GRCh38/star \
--gtf /path/to/GRCh38/genes/genes.gtf \
--chemistry DD-Q \
--include-introns \
--core 4

示例2：FFPE样本单细胞转录数据，使用--scoremin 0.2 --matchnmin 0.33

TIP

对于FFPE样本，建议使用以下参数组合：

--scoremin 0.2：放宽比对得分要求
--matchnmin 0.33：降低匹配碱基数要求
--include-introns：包含内含子区域提高基因覆盖度

shell

seeksoultools fast run \
--fq1 /path/to/ffpe/ffpe_R1.fq.gz \
--fq2 /path/to/ffpe/ffpe_R2.fq.gz \
--samplename demo \
--genomeDir /path/to/GRCh38/star \
--gtf /path/to/GRCh38/genes/genes.gtf \
--scoremin 0.2 \
--matchnmin 0.33 \
--chemistry DD-Q \
--include-introns \
--core 4

软件参数说明

参数	参数说明
--fq1	R1 fastq数据路径。
--fq2	R2 fastq数据路径。
--samplename	样本名称，会在outdir目录下创建以样本名称命名的目录。仅支持数字，字母和下划线。
--outdir	结果输出目录。默认值：./。
--genomeDir	STAR构建的参考基因组路径, 版本需要与SeekSoulTools使用的STAR一致。
--gtf	相应物种的gtf路径。
--rRNAgenomeDir	STAR构建的参考基因组路径,用于rRNA比例评估, 对于非人非鼠物种，该参数可以不指定，当不指定该参数时，用--genomeDir参数值进行核糖体信息统计。如果指定该参数吗，则版本需要与SeekSoulTools使用的STAR一致。
--rRNAgtf	相应物种的gtf路径，用于rRNA比例评估，同样该参数可以不指定。
--core	分析使用的线程数。
--chemistry	试剂类型，每种对应一组`--shift`、`--pattern`、 `--structure`、`--barcode`和`--sc5p`的组合，可选值：DD-Q； DD-Q 对应SeekOne(R) DD单细胞全序列转录组试剂盒。
--skip_misB	barcode不允许碱基错配，默认允许一个碱基错配。
--skip_misL	linker不允许碱基错配，默认允许一个碱基错配。
--skip_multi	舍弃能纠错为多个白名单barocde的reads，默认纠错为比例最高的barcode。
--expectNum	预估的捕获细胞数目。
--forceCell	当正常分析得到的细胞数⽬不理想时，选⽤此参数，后⾯加⼀个预期的数值N，SeekSoulTools软件会按照UMI从⾼到低取前N个细胞。
--include-introns	不启用时，只会选择exon reads⽤于定量；启用时，intron reads也会⽤于定量。
--star_path	指定其他版本的STAR路径进行比对，版本需要与`--genomeDir`版本兼容，默认的`--star_path`为环境下的STAR。
--scoremin	设置STAR比对时的`--outFilterScoreMinOverLread`参数，用于FFPE样本放宽比对要求。该参数根据比对得分来过滤掉一些可能是错误的比对。
--matchnmin	设置STAR比对时的`--outFilterMatchNminOverLread`参数，用于FFPE样本放宽比对要求。该参数根据reads比对上的碱基数来过滤一些部分比对的reads。

结果文件说明

以下是输出目录结构：每一行代表一个文件或文件夹，用 "├──" 表示，数字表示三个重要的输出文件。

shell

.
├── PBMC_report.html
├── PBMC_summary.csv
├── PBMC_summary.json
├── step1
│   ├── PBMC_1.fq.gz
│   ├── PBMC_2.fq.gz
│   ├── PBMC_multi_1.fq.gz
│   ├── PBMC_multi_2.fq.gz
│   └── PBMC_multi.json
├── step2
│   ├── featureCounts
│   │   ├── counts.txt
│   │   ├── counts.txt.summary
│   │   └── PBMC_SortedByName.bam
│   └── STAR
│       ├── downbam
│       │   ├── log.txt
│       │   ├── PBMC.bed
│       │   ├── PBMC.down.0.1.bam
│       │   ├── PBMC.down.0.1.bam.bai
│       │   ├── PBMC.geneBodyCoverage.curves.pdf
│       │   ├── PBMC.geneBodyCoverage.r
│       │   ├── PBMC.geneBodyCoverage.txt
│       │   └── PBMC.reduction.bed
│       ├── PBMC_Log.final.out
│       ├── PBMC_Log.out
│       ├── PBMC_Log.progress.out
│       ├── PBMC_SJ.out.tab
│       ├── PBMC_SortedByCoordinate.bam
│       ├── PBMC_SortedByCoordinate.bam.bai
│       ├── PBMC_SortedByName.bam
│       ├── PBMC__STARtmp
│       ├── report.pdf
│       ├── rnaseq_qc_results.txt
│       └── rRNA
│           ├── counts.txt
│           ├── counts.txt.summary
│           ├── PBMC_Aligned.out.bam
│           ├── PBMC_Aligned.out.bam.featureCounts.bam
│           ├── PBMC_Log.final.out
│           ├── PBMC_Log.out
│           ├── PBMC_Log.progress.out
│           ├── PBMC_SJ.out.tab
│           ├── PBMC__STARtmp
│           └── PBMC.xls
├── step3
│   ├── counts.xls
│   ├── detail.xls
│   ├── filtered_feature_bc_matrix
│   │   ├── barcodes.tsv.gz
│   │   ├── features.tsv.gz
│   │   └── matrix.mtx.gz
│   ├── raw_feature_bc_matrix
│   │   ├── barcodes.tsv.gz
│   │   ├── features.tsv.gz
│   │   └── matrix.mtx.gz
│   └── umi.xls
└── step4
    ├── biotype_FindAllMarkers.xls
    ├── FeatureScatter.png
    ├── FindAllMarkers.xls
    ├── lncgene_FindAllMarkers.xls
    ├── mito_quantile.xls
    ├── nCount_quantile.xls
    ├── nFeature_quantile.xls
    ├── PBMC.rds
    ├── resolution.xls
    ├── top10_heatmap.png
    ├── tsne.png
    ├── tsne_umi.png
    ├── tsne_umi.xls
    ├── umap.png
    └── VlnPlot.png

PBMC_report.html是样本的html报告
PBMC_summary.csv样本的csv格式质控信息
step3/filtered_feature_bc_matrix是经过过滤之后的表达矩阵
step4/PBMC.rds是矩阵经过seurat处理后的rds文件。

处理过程

step1: barcode/UMI提取

SeekSoulTools根据不同的Read1的结构设计和参数对barcode/UMI进行提取和处理，对Read1和Read2进行过滤，输出新的fastq文件。

结构设计和描述

barcode和UMI描述以字母和数字描述Read1的基本结构，字母描述碱基含义，数字描述碱基长度。
B: barcode部分碱基
L: linker部分碱基
U: UMI部分碱基
X: 其他任意碱基，用于占位
以下面两种Read1结构为例:
B8L8B8L10B8U8：
B17U12：
错位设计的Anchor定位 MM设计下，为了增加Linker部分在测序时碱基均衡性，加入了1-4 bp的移码碱基，即anchor，anchor决定了barcode的起始位置。

数据流程

确定anchor

Barcode和Linker矫正

只有唯一一个序列存在于白名单中：我们将这个无效barcode矫正为白名单中barcode；
有多个序列存在于白名单中：我们将这个无效barcode改为read支持数量最多的序列；

Linker的处理与Barcode相同。

接头和PolyA序列剪切

经过上述处理后，数据指标包括：

total: 总共的reads数目
valid: 不需要矫正和矫正成功的reads数目
B_corrected: 矫正成功的reads数目
B_no_correction: 错误Barcode的reads数目
trimmed: 进行过剪切的reads数目
too_short: 进行过剪切后长度小于60bp的reads数目

输出fastq的reads数：total_output = valid - too_short

step2: 进行比对并找到比对基因

序列比对

使用STAR比对软件将处理后的reads1和reads2提取8Mreads比对到核糖体的参考基因组上，用featureCounts将比对上的read定位到基因上，并统计数据中rRNA和Mt_rRNA比例。
使用STAR比对软件将处理后的reads1和reads2比对到参考基因组上。
根据gtf文件找到housekeeping基因ACTB的所有exon位置，并从bam中统计覆盖到超过0.2倍ACTB平均深度的区间的比例。
根据gtf文件，将全部转录本exon区间转成bed格式，并随机抽出10000个转录本的区间进行genebody绘制。
使用QualiMap软件和转录本注释文件GTF，统计reads比对外显子、内含子和基因间区等的比例。
使用featureCounts将比对上的read注释到基因上，可以选择不同的注释规则，如链方向性和定量的feature。当使用外显子定量时，当read>超过50%碱基比对到外显子区域时，认为该read来源于此外显子以及外显子对应的基因；当使用转录本定量时，当read超过50%碱基比对到转录本区域时，认为该read来源于此转录本以及转录本对应的基因。

经过上述处理后，有如下数据指标：

Reads Mapped to Genome: 比对到参考基因组上的reads占所有reads的比例（包括只有一个比对位置和多个比对位置的reads）
Reads Mapped to Middle Genebody：在genebody中，覆盖转录本的25%-75%区间的比例。
Reads Mapped Confidently to Genome: 在参考基因组上只有一个比对位置的reads占所有reads的比例
Fraction over 0.2 mean coverage depth of ACTB gene：超过ACTB基因平均覆盖深度0.2x区间占ACTB基因长度的比例。
rRNA% in Mapped：数据中核糖体基因的占比。
Mt_rRNA% in Mapped：数据中线粒体核糖体基因的占比。
Reads Mapped to Intergenic Regions：比对到基因间隔区reads占所有reads的比例
Reads Mapped to Intronic Regions：比对到内含子reads占所有reads的比例
Reads Mapped to Exonic Regions：比对到外显子reads占所有reads的比例

step3: 定量

UMI定量

SeekSoulTools以barcode为单位提取featureCounts输出的bam数据，统计注释到基因的UMI和UMI对应的reads数：

过滤掉对应UMI为单个重复碱基的reads，例如UMI为TTTTTTTT
当read注释到多个基因，在有唯一外显子的注释时，为有效read，其他情形下都过滤掉

UMI矫正

测序过程中，UMI也有一定概几率出现测序错误。SeekSoulTools默认使用UMI-tools的adjacency方法对UMI进行矫正。

Schematic from UMI-tools 图片来源: https://umi-tools.readthedocs.io/en/latest/the_methods.html

细胞判定

在一个细胞群中，我们认为细胞和细胞的mRNA的含量不会相差太多。如果一个barcode对应的mRNA的含量很低，我们认为这个barcode的磁珠并没有捕获细胞，mRNA来源于背景。SeekSoulTools会以上面的规则，进行barcode是否为细胞的判定。有以下几个步骤：

对所有barcode按照对应的UMI数由高到低排序；
取预估细胞的1%位置的barcode的UMI数除以10为阈值；
barcode的UMI数大于阈值的判定为细胞；
barocde的UMI小于阈值，但大于300时，使用DropletUtils分析。DropletUtils方法先假设UMI数量低于100的barcode为empty droplet，然后根据每个droplet相同基因的UMI数总和为背景RNA表达谱中该基因UMI数目，进而得到基因UMI数目的期望值。再通过将每个barcode的UMI数进行统计学检验，显著差异的为细胞；
不符合上述条件的为背景。

经过上述处理后，有如下数据指标：

Estimated Number of Cells: 算法判定的细胞总数
Fraction Reads in Cells: 判定为细胞的reads占所有参与定量的reads的比例
Mean Reads per Cell: 细胞的平均reads数，总reads数/判定的细胞数
Median Genes per Cell: 判定为细胞的barcode中基因数的中位数
Median lnc Genes per Cell：判定为细胞的barcode中biotype属于lncRNA的基因数的中位数
Median UMI Counts per Cell: 判定为细胞的barcode中UMI数的中位数
Total Genes Detected: 所有细胞检测到基因数量
Sequencing Saturation: 饱和度，1 - UMI总数/reads总数

step4: 后续分析

经过上述定量，得到表达矩阵后，我们可以进行下一步的分析。

Seurat分析流程

使用Seurat计算线粒体含量，细胞中UMI总数，细胞中基因总数。之后对矩阵进行归一化、寻找高变基因、降维聚类之后寻找差异基因。

vdj模块参考vdj模块

multivdj模块参考multivdj模块

utils模块

addtag

对bam进行修改，添加barcode和umi标签。

运行示例

为分析设置必要的配置文件，包括样本的bam文件和step3目录下的umi.xls文件。使用以下命令运行SeekSoulTools：

shell

seeksoultools utils addtag \
    --inbam step2/featureCounts/Samplename_SortedByName.bam \
    --umifile step3/umi.xls \
    --outbam Samplename_addtag.bam

软件参数说明

参数	参数说明
--inbam	输入的bam,step2 featureCount目录下的bam文件。
--outbam	addtag之后的bam文件名称
--umifile	输入的umi文件，seeksoultools输出目录step3的umi.xls文件

常见问题

IMPORTANT

以下是使用SeekSoul Tools时的常见问题及解决方案，可帮助您快速排除故障。

如何构建参考基因组？

参考基因组的构建请参考如何构建参考基因组？。

chemistry 如何选择？

CAUTION

chemistry参数的选择对分析结果有重要影响。选择错误会导致barcode识别率低，影响后续分析。

chemistry参数的设定跟所用试剂类型相关，比如全序列和FFPE产品选择DD-Q，DD单细胞3'转录组试剂盒请选择DD—V2， DD单细胞5'转录组试剂盒选择DD5V1等。如果chemistry参数选择错误可直接在log日志中查找"valid barcode rate of"相关信息，后面的比例太低则表示chemistry不正确。或者在samplename_summary.json文件中可查看valid 和total的比例。

fastq.gz文件有问题。

软件报错"Error while decompressing extra concatenatedgzip files on *fastq.gz\n"? 根据提示，输出的fq文件应该是不完成的，请核对参数--fq1 --fq2参数的文件是否完整。同样是fq数据不完整，也可能出现如下错误信息"FileFormatError: Error in sequence file at unknown line: Reads are improperly paired. There are more reads in file 1 than in file 2." 或者"Error in FASTQ file at line 4: Premature end of file encountered. The incomplete final record was: '@A01565:134:HKFGNDSX3:1:1101:11080:2957 1:N:0:CACTTCGA+ACAGCTGC\nCCATCACTACGGAAGGTTGAGCTCTATGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAACCGCGATTTCCTTATTATTGTTAATACCCACCATTTTTAATCCAACCCCCCCGGGATTATTATCCTTAATATTATTATT\n+\n' err!!!",总而言之，请一定确保自己的fq文件是完整且配对的。

没有barcodes.tsv.gz文件。

软件报错"No such file or directory: '/outputpath/samplename/step3/filtered_feature_bc_matrix/barcodes.tsv.gz'" ? 首先查看输出目录，如果有raw_feature_bc_matrix,并且该目录下的三个文件大小没有异常小，此时可以单独运行一个细胞判定的脚本Rscript /path/seeksoultools/lib/python3.XX/site-packages/seeksoultools/utils/cell_identify.R -i outputpath/step3/raw_feature_bc_matrix -e 3000（该命令在日志中有输出） ,当执行此脚本时应该会出现报错信息，比如缺少某个R包的问题，此时请确认，1.2.1版本之前的，在脚本执行的时候先激活环境，比如请执行 source activate seeksoultools，或者export PATH=/path/seeksoultools/bin:$PATH，激活环境后重新运行脚本。另外温馨提示，在安装seeksoultools软件时不要把它软链到另一个磁盘等，请直接安装，并且保证环境名称是唯一的，在运行脚本的时候使用绝对路径。

如果检查输出目录中raw_feature_bc_matrix目录下的文件大小异常小，比如只有几个字节大小，此时可能是gtf文件有问题。具体的gtf格式说明及要求，可以参考{ref}ref-label。

samtools报错

软件报错"stderr: samtools sort: failed to read header from '/outputpath/samplename/.test/test_1M_Aligned.out.bam'"? 根据提示bam文件有问题，此时请查看/outputpath/samplename/.test/test_1M_Log.out。文件可能会提示'FATAL INPUT ERROR: unrecognized parameter name "genomeType" in input "genomeParameters.txt"',或者'EXITING because of FATAL ERROR: Genome version: 2.7.1a is INCOMPATIBLE with running STAR version: 2.7.10a SOLUTION: please re-generate genome from scratch with running version of STAR, or with version: 2.7.4a'也会提示索引的版本和STAR软件的版本。报错原因是二者版本不一致，请给软件传递参数--star_path 给定构建索引用的STAR软件路径。

用1.2.2版本seeksoultools分析完数据得到的web summary中线粒体比例都是0？

seeksoultools是根据gtf中gene_name的value中是否以Mt- 或者mt- 开头来判断线粒体基因的，如果gtf中gene_name的value没有进行这种修改就会导致报告中mt比例均为0.

"rnaseq_qc_results.txt"文件没有？

软件报错"No such file or directory: '/outputpath/samplename/step2/STAR/rnaseq_qc_results.txt'" 根据提示，软件在qualimap步骤运行失败，对于1.2.1及其之前的版本，需要在下载完软件包之后进行unpack。具体操作方式为："source ./bin/activate ; ./bin/conda-unpack"

biotype的问题

软件运行报错"gene_biotype = re.search(r'(gene_type|gene_biotype|transcript_biotype|transcript_type) "(.*?)";', ids).group(2) AttributeError: 'NoneType' object has no attribute 'group'" 在1.2.1及其之前版本fast模块要求gtf文件的attribute列中有记录gene的biotype，当出现这个提示的时候，可以修改gtf文件，确保gene有biotype，或者可以用1.2.2及其之后的版本，当读取不到基因的biotype是，默认type为"undefine"。

关注的某个基因，最后矩阵中为什么表达量都是0？

在进行定量的时候，如果某条reads即比对到A基因又比对到B基因，在1.2.0之前的版本是直接丢掉，1.2.0及其之后的版本会对基因的位置做进一步判定，如果只有某个基因比对到的是exon区间，其他基因比对的是非exon区间，则将该reads判定给该基因。进行排查时，首先从step2/featureCounts/*_SortedByName.bam里面提取出'XT'tag中包含该基因（ensemble id 而非symbol）的reads，然后针对这些reads逐条检查，是不是XTtag中包含的多个基因，且目标基因比对的区域非exon或者XTtag包含的基因中有多个是比对的exon区域。

Too many open files

报错显示Failed to open file "/path/samplename_SortedByCoordinate.bam.tmp.1020.bam": Too many open files。该错误一般发生在samtools sort命令。可以用ulimit -n查看当前系统允许每个进程打开的最大文件，可以通过ulimit -n 8000来增大可打开文件数量。如果用户没有权限修改，则可以尝试减小线程和增大内存，比如设置-@ 1 -m 3G

qualimap文件没有生成

在运行日志最后显示"Starting BAM file analysis"，没有其他错误提示。在outdir目录中只有.test文件夹，没有预期的step1 step2等。该错误发生在qualimap步骤，可查看运行日志前面，应该会有"WARNING: out of memory! Qualimap allows to set RAM size using special argument: --java-mem-size Check more details using --help command or read the manual."提示。可以通过修改

发布说明

v1.3.0

更新vdj模块的算法
统一了输出路径名称
fast和ffpe模块去掉reads1umi后17bp低质量碱基

v1.2.2

添加vdj分析模块
fast模块对FFPE样本的支持
修复gtf中没有lncRNA类型引起基因中位数的统计错误
解决基因名称重复导致差异基因缺失EnsemblID的问题
其他改进，提升易用性

v1.2.1

更新报告样式
增加SP1、SP2和TSO和接头的剪切
增加对bam添加addtag的工具
增强对非标准gtf的支持
fast模块支持人和鼠之外的物种

v1.2.0

增加去除barcode和umi序列后的read1的fq文件输出
添加fast分析模块
应用UMI-tools的矫正方法
更新read注释到多个基因时的处理规则：在有唯一外显子的注释时，视为有效read

v1.0.0

首次发布

SeekSoul Tools v1.3.0 ​

软件下载 ​

软件安装 ​

安装： ​

使用教程 ​

rna模块 ​

数据准备 ​

测试数据下载 ​

参考基因组下载和构建 ​

运行 ​

运行示例 ​

软件参数说明 ​

结果文件说明 ​

处理过程 ​

step1: barcode/UMI提取 ​

结构设计和描述 ​

数据流程 ​

接头和PolyA序列剪切 ​

step2: 进行比对并找到比对基因 ​

序列比对 ​

step3: 定量 ​

UMI定量 ​

UMI矫正 ​

细胞判定 ​

step4: 后续分析 ​

Seurat分析流程 ​

fast模块 ​

数据准备 ​

测试数据下载 ​

参考基因组下载和构建 ​

运行 ​

运行示例 ​

软件参数说明 ​

结果文件说明 ​

处理过程 ​

step1: barcode/UMI提取 ​

结构设计和描述 ​

数据流程 ​

接头和PolyA序列剪切 ​

step2: 进行比对并找到比对基因 ​

序列比对 ​

step3: 定量 ​

UMI定量 ​

UMI矫正 ​

细胞判定 ​

step4: 后续分析 ​

Seurat分析流程 ​

vdj模块参考vdj模块 ​

multivdj模块参考multivdj模块 ​

utils模块 ​

addtag ​

运行示例 ​

软件参数说明 ​

常见问题 ​

如何构建参考基因组？ ​

chemistry 如何选择？ ​

fastq.gz文件有问题。 ​

没有barcodes.tsv.gz文件。 ​

samtools报错 ​

用1.2.2版本seeksoultools分析完数据得到的web summary中线粒体比例都是0？ ​

"rnaseq_qc_results.txt"文件没有？ ​

biotype的问题 ​

关注的某个基因，最后矩阵中为什么表达量都是0？ ​

Too many open files ​

qualimap文件没有生成 ​

发布说明 ​

v1.3.0 ​

v1.2.2 ​

v1.2.1 ​

v1.2.0 ​

v1.0.0 ​

SeekSoul Tools v1.3.0

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参考基因组下载和构建

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结构设计和描述

数据流程

接头和PolyA序列剪切

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序列比对

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UMI定量

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结构设计和描述

数据流程

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step2: 进行比对并找到比对基因

序列比对

step3: 定量

UMI定量

UMI矫正

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Seurat分析流程

vdj模块参考vdj模块

multivdj模块参考multivdj模块

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常见问题

如何构建参考基因组？

chemistry 如何选择？

fastq.gz文件有问题。

没有barcodes.tsv.gz文件。

samtools报错

用1.2.2版本seeksoultools分析完数据得到的web summary中线粒体比例都是0？

"rnaseq_qc_results.txt"文件没有？

biotype的问题

关注的某个基因，最后矩阵中为什么表达量都是0？

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