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全序列-可变剪接分析 ​

作者: 冯书燕
时长: 8 分钟
字数: 2.0k 字
更新: 2025-09-05
阅读: 0 次
SeekOne 全序列

介绍 ​

NOTE

可变剪接（alternative splicing）又称作选择性剪接，是指在真核生物的基因转录过程中，前体RNA经过不同的剪接形式，产生多个不同的转录本。在这个剪接过程中，不同的外显子和内含子可以选择性地被剪除或保留。

IMPORTANT

寻因研发的全序列测序技术（scFAST-seq），是基于随机引物来捕获RNA分子，在单细胞的转录组水平上实现了全长覆盖，从而为可变剪接分析创造了机会和可能。这项转录组测序技术是基于droplet-based原理的高通量测序技术，因此，我们更建议在细胞群水平或样本水平上进行可变剪接分析。

rMATS分析软件 ​

一、软件介绍 ​

我们使用了rMATS来分析可变剪接，rMATS（eplicate Multivariate Analysis of Transcript Splicing）是一个基于RNA-seq数据来分析差异性可变剪接事件的软件。rMATS可以识别不同类型的可变剪接事件，包含 SE，A5SS，A3SS，MXE和RI五种类型。

img

对识别到的可变剪接事件，rMATS分别按照两种不同的计算方式来统计支持reads数。（JC，Junction Counts；JCEC，Junction Counts and Exon Counts）

​

二、软件安装 ​

1）conda安装rMATS: ​

TIP

推荐使用conda来安装rMATS软件，首先创建一个新的conda环境，您也可以选择激活已有环境：

shell
conda create -n rMATS_env
conda activate rMATS_env

安装:

shell
conda install bioconda::rmats

运行成功后，rMATS就安装好了。

2）配置环境： ​

IMPORTANT

运行后续代码，需要配置一些必要的工具，按照以下示例分别安装python包和R包：

shell
# install python packages
python -m pip install pysam click 

# install R
conda install r-base

# install R packages
Rscript -e 'install.packages(c("argparse", "Seurat"))''

至此，分析环境已经配置完成了！

示例数据和脚本下载 ​

在这里为您提供了相应的示例数据和分析脚本，来帮助您理解后续的分析流程。该数据均来源于寻因官网PBMC数据。

shell
wget https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/FAST/rMATS_demo.tar.gz
tar -zxvf rMATS_demo.tar.gz

NOTE

示例数据包含3个文件：

  • PBMC.rds 是基于SingleCellExperiment格式的单细胞数据
  • PBMC_chr1.bam 是从PBMC样本测序数据与GRCh38基因组的比对结果中抽取了1号染色体上的比对数据作为示例
  • genes.gtf 是基于GRCh38版本的基因组注释文件

三个脚本中，getbarcode.R 是用于读取rds的细胞barcode信息和分组信息；rmats_run.py首先根据指定的分组信息对bam文件进行拆分，然后使用rMATS来识别可变剪接事件，并在指定分组之间计算差异表达水平。run.sh是直接调用的运行脚本。

运行示例 ​

CAUTION

运行以下命令前，请确保已激活环境：

shell
conda activate rMATS_env

运行以下命令，完成可变剪接分析：

shell
# create output path
mkdir -p /path/result

# run
python /path/rmats_run.py \
	--samplename demo \
	--rds /path/demodata/PBMC.rds \
	--outdir /path/result \
	--bam /path/demodata/PBMC_chr1.bam \
	--gtf /path/demodata/genes.gtf \
	--cellanno seurat_clusters

上述参数含义为：

参数名称参数含义
samplename样本名称
rds基于SingleCellExperiment格式的数据，Seurat对象
outdir输出目录
bam比对结果文件
gtf基因组注释文件
cellanno指定的metadata名，需存在于rds里。注：cellanno列不能包含"/"

TIP

小编用示例数据运行，在4core16GB的环境下，运行了28分钟左右。

结果解读 ​

运行完成后得到了哪些结果？又该如何理解呢？接下来，为您简单介绍结果内容。

首先，查看结果目录，可以看到输出结果按照指定的cluster分为了不同的文件夹，以cluster0为例：

tree -L 1 result/cluster0/
result/cluster0/
├── A3SS.MATS.JCEC.txt
├── A5SS.MATS.JCEC.txt
├── demo.b1.txt
├── demo.b2.txt
├── demo_cluster0_A3SS.MATS.JC.txt
├── demo_cluster0_A5SS.MATS.JC.txt
├── demo_cluster0_MXE.MATS.JC.txt
├── demo_cluster0_RI.MATS.JC.txt
├── demo_cluster0_SE.MATS.JC.txt
├── fromGTF.A3SS.txt
├── fromGTF.A5SS.txt
├── fromGTF.MXE.txt
├── fromGTF.novelJunction.A3SS.txt
├── fromGTF.novelJunction.A5SS.txt
├── fromGTF.novelJunction.MXE.txt
├── fromGTF.novelJunction.RI.txt
├── fromGTF.novelJunction.SE.txt
├── fromGTF.novelSpliceSite.A3SS.txt
├── fromGTF.novelSpliceSite.A5SS.txt
├── fromGTF.novelSpliceSite.MXE.txt
├── fromGTF.novelSpliceSite.RI.txt
├── fromGTF.novelSpliceSite.SE.txt
├── fromGTF.RI.txt
├── fromGTF.SE.txt
├── JCEC.raw.input.A3SS.txt
├── JCEC.raw.input.A5SS.txt
├── JCEC.raw.input.MXE.txt
├── JCEC.raw.input.RI.txt
├── JCEC.raw.input.SE.txt
├── JC.raw.input.A3SS.txt
├── JC.raw.input.A5SS.txt
├── JC.raw.input.MXE.txt
├── JC.raw.input.RI.txt
├── JC.raw.input.SE.txt
├── MXE.MATS.JCEC.txt
├── RI.MATS.JCEC.txt
├── SE.MATS.JCEC.txt
├── summary.txt
└── tmp
1 directory, 38 files

上述txt文件是rMATS对cluster0相对其余cluster进行的差异可变剪切分析结果，各个文件介绍可以参考rMATS官方说明： rmats-turbo/README.md at v4.3.0 · Xinglab/rmats-turbo (github.com)

在此，为您介绍主要的输出结果内容：

一、主要结果 demo_cluster0_*.MATS.JC.txt ​

该结果分为 SE，A5SS，A3SS，MXE和RI五个文件，分别对应5种可变剪接类型。

image-20240611143931080

内容包含了各个剪接事件的起始结束、比对reads的详细信息，并就cluster0和其他所有cluster之间计算了各剪接事件的差异水平。各列描述为：

（1）ID:rMATS event id

（2）GenelD: 可变剪接事件所在基因编号

（3）geneSymbol: 可变剪接事件所在基因名称

（4）chr: 可变剪接事件所在染色体

（5）strand: 可变剪接事件所在染色体链的方向

（6）ExonStart_0base: 可变剪接事件跳跃外显子的起始位置，以0开始计数

（7）ExonEnd: 可变剪接事件跳跃外显子的终止位置

（8）upstreamES: 可变剪接事件跳跃外显子的上游exon起始位置

（9）upstreamEE: 可变剪接事件跳跃外显子的上游exon终止位置

（10）downstreamES: 可变剪接事件跳跃外显子的下游exon起始位置

（11）downstreamEE: 可变剪接事件跳跃外显子的下游exon终止位置

（12）ID:rMATS event id

（13）IJC_SAMPLE_1: 样本一在inclusion junction（IJC）下的count数，重复样本的结果以逗号分隔

（14）SJC_SAMPLE_1: 样本一在skipping junction（SJC）下的count数，重复样本的结果以逗号分隔

（15）IJC_SAMPLE_2: 样本二在inclusion junction（IJC）下的count数，重复样本的结果以逗号分隔

（16）SJC_SAMPLE_2: 样本二在skipping junction（SJC）下的count数，重复样本的结果以逗号分隔

（17）IncFormLen: 可变剪接事件Exon Inclusion Isoform的有效长度

（18）SkipFormLen: 可变剪接事件Exon Skipping Isoform的有效长度

（19）PValue: 两组样本间可变剪接事件表达差异显著性p值

（20）FDR: 可变剪接事件表达差异显著性FDR值

（21）IncLevel1: 处理组可变剪接事件Exon Inclusion Isoform在两个Isoform总表达量的比值

（22）IncLevel2: 对照组可变剪接事件Exon Inclusion Isoform在两个Isoform总表达量的比值

（23）IncLevelDifference: IncLevel1与IncLevel2的差值

二、主要结果 summary.txt ​

image-20240611144815613

该文件是对cluster0的差异可变剪接事件的汇总，统计了 FDR<0.05 的可变剪接事件数量。

其中 SignificantEventsJC/JCEC 是 SigEventsJC/JCECSample1HigherInclusion 和 SigEventsJC/JCECSample2HigherInclusion 的加和。JC和JCEC是指由两种不同计算方式各自得到的结果。

TIP

更多结果的查询和了解可以移步rMATS官网https://github.com/Xinglab/rmats-turbo/blob/v4.3.0/README.md

参考文献： ​

Shen S., Park JW., Lu ZX., Lin L., Henry MD., Wu YN., Zhou Q., Xing Y. rMATS: Robust and Flexible Detection of Differential Alternative Splicing from Replicate RNA-Seq Data. PNAS, 111(51):E5593-601. doi: 10.1073/pnas.1419161111

rMATS/rMATS-turbo (sourceforge.io)

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